UPLC 同時測定蜘蛛香中9 種成分

程盛勇 ，付 洋，陳 慧，尹 航，劉興賦，羅喜榮*，楊 軍

（1.貴州醫科大學藥學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫科大學附屬醫院，貴州 貴陽 550004；3.中國科學院地球化學研究所，貴州 貴陽 550081）

蜘蛛香Valeriana jatamansiJones 又名養血蓮、臭藥、馬蹄香、鬼見愁等，為多年生草本植物，以干燥根莖和根入藥，具有理氣止痛、祛風除濕、鎮驚安神、消食止瀉之功效［1-4］。現代藥學研究表明蜘蛛香主含揮發油、纈草三酯類、黃酮類、酚酸類、生物堿、氨基酸、木酯素和多糖等成分，具有抗腫瘤、抗焦慮、神經保護、保肝、抗氧化、抗菌、抗病毒等藥理作用，有良好的新藥開發潛力［3-11］。現行蜘蛛香質量標準較簡單，其質量控制主要是TLC 法鑒別纈草三酯和乙酰纈草三酯，尚無含有量測定項，藥材質量控制及評價困難，亟待建立可靠的蜘蛛香質量評價體系。中藥成分復雜，發揮療效的成分難以確定，開展指紋圖譜研究和多成分含有量測定并建立質量標準，是保障中藥質量和療效一致性的有效方法［12］。課題組前期蜘蛛香指紋圖譜研究發現新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、橙皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、乙酰纈草三酯和纈草三酯可作為蜘蛛香的定性鑒別和質量差異標記物［13-14］，本實驗建立UPLC 法同時測定蜘蛛香中9 種成分的含有量，旨在為蜘蛛香的質量標準完善、臨床用藥及新藥開發提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1290 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；BSA224S 型電子天平（德國賽多利斯公司）；KQ3200E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FW177 型中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 新綠原酸（MUST-15011412）、綠原酸（MUST-15041814）、咖啡酸（MUST-15090803）、異綠原酸B（MUST-15081411）、異綠原酸A（MUST-15042518）、異綠原酸C（MUST-15081414）對照品均購自成都曼思特生物科技有限公司；橙皮苷對照品（602F022）購自北京索萊寶科技有限公司；乙酰纈草三酯（wkq16072004）、纈草三酯（wkq16011203）對照品均購自四川維克奇生物科技有限公司，質量分數均≥98%；乙腈、甲醇為色譜純；水為娃哈哈純凈水；其余試劑均為分析純。21 批蜘蛛香樣品來源信息見表1，經貴州醫科大學生藥學教研室覃容貴教授鑒定為敗醬科植物蜘蛛香Valeriana jatamansiJones 的干燥根莖及根。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Ultimate?UHPLC Polar-RP 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相乙腈（A）-0.1% 甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～6 min，12%～35% A；6～10 min，35%～50% A；10～11 min，50%～57% A；11～30 min，57% A）；體積流量0.21 mL/min；檢測波長327 nm（0～11 min），256 nm（11～30 min）；柱溫30 ℃；進樣量0.8 μL；色譜圖見圖1。

圖1 各成分UPLC 色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms of various constituents

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取9 種成分對照品適量，用70%甲醇溶解分別制成各成分的對照品貯備液。精密量取上述9 種對照品貯備液，加70%甲醇溶解并稀釋成分別含60.00 μg/mL 新綠原酸、220.00 μg/mL 綠原酸、44.00 μg/mL 咖啡酸、380.00 μg/mL 橙皮苷、210.00 μg/mL 異綠原酸B、360.00 μg/mL 異綠原酸A、150.00 μg/mL 異綠原酸 C、169.20 μg/mL 乙酰纈草三酯、690.00 μg/mL 纈草三酯的混合對照品溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取蜘蛛香藥材打粉，過60 目篩，稱取粉末0.2 g，置棕色EP 管中，加入70%甲醇10 mL，稱定質量，于37 ℃超聲（150 W，40 kHz）提取40 min，冷卻至室溫，稱定質量，用70%甲醇補足減失質量，經0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 取混合對照品溶液適量，70% 甲醇制成系列質量濃度對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣，記錄各成分峰面積。以溶液質量濃度為橫坐標（X），對應的色譜峰峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，結果見表2。表明各成分在各自范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.2 精密度試驗 精密吸取對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣6 次，測得新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、橙皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、乙酰纈草三酯、纈草三酯峰面積RSD 分別為 1.84%、0.95%、1.32%、2.19%、1.26%、1.51%、1.24%、1.27%、0.63%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復性試驗 取貴州貴陽（S2）蜘蛛香藥材細粉6 份，按“2.2.2”項下方法平行制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下分別進樣，測得新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、橙皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、乙酰纈草三酯、纈草三酯含有量RSD 分別為0%、0.49%、0%、1.35%、0.98%、0.18%、0.18%、0.20%、0.10%，表明該方法重復性良好。

2.3.4 穩定性試驗 精密吸取貴州貴陽（S2）供試品溶液，室溫放置0、3、6、9、12、24 h 后，在“2.1”項色譜條件下進樣，測得新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、橙皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、乙酰纈草三酯、纈草三酯峰面積RSD 分別為 2.33%、1.17%、2.23%、1.35%、1.53%、0.80%、1.41%、1.56%、1.18%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 精密稱取6 份已知測含有量的貴州貴陽（S2）蜘蛛香藥材粉末0.02 g，分別精密加入150.00 μg/mL 新綠原酸對照品溶液0.032 mL、220.00 μg/mL 綠原酸對照品溶液0.108 mL、220.00 μg/mL 咖啡酸對照品溶液0.003 mL、190.00 μg/mL 橙皮苷對照品溶液0.271 mL、210.00 μg/mL 異綠原酸B 對照品溶液0.020 mL、240.00 μg/mL 異綠原酸A 對照品溶液0.135 mL、200.00 μg/mL 異綠原酸C 對照品溶液0.080 mL、350.00 μg/mL 乙酰纈草三酯對照品溶液0.165 mL、230.00 μg/mL 纈草三酯對照品溶液0.902 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下測定峰面積。計算各成分回收率，結果見表3。

2.4 樣品含有量測定 取表1 中21 批樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下測定峰面積，計算蜘蛛香中9 種指標成分的含有量，結果見表4。

3 討論

纈草三酯類成分具有鎮靜催眠、抗焦慮、抗病毒、血管舒張等多種藥理作用，2015 年版《中國藥典》將纈草三酯和乙酰纈草三酯作為蜘蛛香藥材的質量控制指標；新綠原酸、綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C 等綠原酸類成分具有清除自由基、抗菌消炎、活血降壓等生物活性，是2015 年版《中國藥典》金銀花、山銀花、茵陳、菊花等許多中藥材和小兒咽扁顆粒、風熱清口服液、全杜仲膠囊等多種成品藥質量控制的重要指標；咖啡酸具有抗菌、抗病毒等藥理作用，2015年版《中國藥典》將咖啡酸作為蒲公英、冬葵果的指標成分；橙皮苷是蜘蛛香的主要成分之一，含有量高，穩定性好，臨床上常作為治療高血壓的輔助藥和止血藥，其復合劑也用于治療類風濕性關節炎和風濕熱，2015 年版《中國藥典》將橙皮苷作為陳皮、青皮、橘紅等中藥材和陳丸、人參養榮丸等成方制劑的指標成分。因此，本實驗選擇該9 種成分具有良好的代表性，可作為蜘蛛香藥材的質量分析指標。

表3 各成分加樣回收率試驗結果（，n=6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（，n=6）

表3 各成分加樣回收率試驗結果（，n=6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（，n=6）

表4 各成分含有量測定結果（%，，n=3）Tab.4 Results of content determination of various constituents（%，，n=3）

表4 各成分含有量測定結果（%，，n=3）Tab.4 Results of content determination of various constituents（%，，n=3）

本實驗以9 種成分色譜峰的分離度、峰形及分析時間為評價指標，考察了水及20%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%甲醇9 種溶劑對9 種成分提取的影響，發現70%甲醇的提取效果最好；利用UPLC-DAD 檢測器于190～400 nm 掃描供試品溶液和混合對照品溶液，發現乙酰纈草三酯、纈草三酯最大吸收波長為256 nm［3，15］，橙皮苷最大吸收波長為284 nm，新綠原酸等6 種被測酚酸類成分最大吸收波長為327 nm［10］，所選用的最大吸收波長均與文獻報道一致，為便于實驗操作確定0～11 min 檢測波長為327 nm、11～30 min 檢測波長為256 nm。根據Van Deemter 理論，色譜柱粒徑越小，塔板數高度越低，柱效越高，考察了不同型號色譜柱，結果顯示Ultimate?UHPLC Polar-RP（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）柱效較佳、各色譜峰響應值較高、峰形較好、各成分均能達到有效分離，30 min 內即可實現蜘蛛香中9 種成分有效分離，可大大提高分析效率，同時減少試劑用量，降低分析成本。考察了乙腈/甲醇-水流動相體系，并水中添加酸試劑，結果發現9 種成分色譜峰峰形在乙腈-0.1%甲酸水溶液梯度洗脫系統中基線平穩、分離效果最好，可達到分離度要求。

2015 年版《中國藥典》（一部）中蜘蛛香藥材無含有量測定方法，不能準確反映其內在質量；單一的化學成分難以全面保障和反映藥材的品質及有效性，相較于現有蜘蛛香成分含有量的測定［10，16-19］，本實驗應用波長切換法建立UPLC 法同時測定蜘蛛香中9 種成分的含有量，包括6 種酚酸類（新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C）、1 種黃酮類（橙皮苷）、2 種纈草三酯類（乙酰纈草三酯、纈草三酯），共3 種化學結構類型，具有簡便快捷、結果準確、專屬性好等特點，適用于蜘蛛香的質量控制，測定的成分較多，能更全面地反映其內在質量，有利于蜘蛛香質量標準提升，以期為蜘蛛香新藥研發及藥理研究提供參考。中藥材品質可能與藥材的生長環境、生長年限、根莖粗細、采收時間、貯藏條件等因素有關，為保證蜘蛛香的臨床用藥質量和療效，應規范其適宜采收期、保存時間和指標成分含有量限度。實驗結果表明，不同產地蜘蛛香藥材中9 種成分含有量差異較大，RSD 為24.34%～72.00%，其中纈草三酯、橙皮苷、異綠原酸A、綠原酸的含有量較高分別占總量的 37.10%、20.28%、15.45%、12.95%，為保證蜘蛛香的臨床療效，建議蜘蛛香中纈草三酯、橙皮苷、異綠原酸A、綠原酸含有量分別不得少于 1.035%、0.566%、0.431%、0.361%。