基于UPLC 替代對照品法測定大蒜中大蒜辣素

楊 亮，羅春霞，劉鐘山，賀俊妮，楊光勇，關 明*

（1.新疆師范大學化學化工學院，新疆 烏魯木齊 830054；2.陜西師范大學化學化工學院，陜西 西安 710062；3.新疆維吾爾自治區產品質量監督檢驗研究院，新疆 烏魯木齊 830011；4.新疆警察學院，新疆 烏魯木齊 830011）

大蒜為百合科植物蒜Allium stantivumL.的地下鱗莖，是人們日常生活中常見的藥食兩用的蔥屬植物［1］，在當今回歸自然，高度重視食品和藥品質量安全的潮流中，大蒜由于具有抑菌［2-3］、殺菌［4］、防癌抗癌［5-8］、防治心腦血管疾病［9-10］、提高免疫力等功效［11-13］，成為爭相研究的熱題。

大蒜中有機硫化合物的存在，是其和其他蔥屬植物的特征，且不同的蔥屬植物含有不同的有機硫化合物［14］。完整的大蒜鱗莖中含有蒜氨酸和蒜酶，當大蒜組織被破壞時，蒜氨酸被位于細胞質中的蒜氨酸酶酶解后形成硫代亞磺酸酯。大蒜辣素是大蒜中主要的硫代亞磺酸酯，占大蒜總硫代亞磺酸酯的70%～80%。大蒜辣素等硫代亞磺酸酯是活性分子，根據溫度、pH 和溶劑的不同會發生一定數量的轉換，生成二烯丙基硫醚、二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚、阿霍烯等不同的有機硫化合物。

目前公認的大蒜的主要功效成分是大蒜辣素。有關大蒜辣素含有量測定的方法有很多，如定硫法、電化學方法、生物檢定方法、薄層掃描法、紫外法、氣相色譜法［15］等，但都由于各自的缺陷問題而無法得到廣泛應用。HPLC 法較為常用，能夠準確地測定大蒜辣素的含有量。但是，該法需使用大蒜辣素對照品進行檢測，由于大蒜辣素對照品或標準品價格昂貴，需在零下80 ℃儲存、運輸，且檢測時易降解，因而限制了該方法的應用。面對這一問題，目前所報道的最好的解決方式是采用替代對照品法或一測多評法。主要采用性質穩定、廉價易得的化合物作為替代對照品，利用其與供試品溶液中一個待測物或多個待測物之間的恒定響應關系，實現含有量測定。

《歐洲藥典》［16］《英國藥典》［17］以羥苯丁酯為替代對照品，采用HPLC 法測定了大蒜粉中大蒜辣素的含有量。袁耀佐等［18］參考《歐洲藥典》方法，建立以羥苯乙酯為替代對照品的HPLC 法，用于測定鮮蒜中大蒜辣素的含有量，該方法與《歐洲藥典》中以羥苯丁酯為替代對照品的方法相比，分析時間明顯縮短。

UPLC 法具有分離效率更高、選擇性更好、檢測靈敏度更高的優勢。本實驗借鑒前人的研究成果，以羥苯乙酯為替代對照品，建立UPLC 法快速測定大蒜辣素，以期為完善大蒜質量分析方法提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 蒜氨酸對照品（質量分數93.68%，新疆埃樂欣藥業有限公司）；羥苯乙酯（質量分數99%，中國食品藥品檢定研究院）；蒜酶（1 000 U/g，新疆埃樂欣藥業有限公司）；甲酸（色譜純，天津市福晨化學試劑廠）；甲醇、乙腈（色譜純，美國Sigma-Aldrich 公司）；新鮮大蒜委托烏魯木齊西八家戶路生鮮傳奇超市購買，經新疆師范大學關明教授鑒定為蔥屬植物大蒜Allium stantivumL.的地下鱗莖。

1.2 儀器 Waters Acquity UPLC 超高效液相色譜儀、PDA 檢測器（美國Waters 公司）；Waters Acquity BEH C18色譜柱（2.1 mm ×100 mm，1.7 μm，美國Waters 公司）。色譜圖見圖1。

圖1 各成分UPLC 色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms of various constituents

1.3 對照品溶液制備

1.3.1 羥苯乙酯對照溶液 參考文獻［19］，精密稱取一定量的羥苯乙酯溶解于50%甲醇水溶液中，制備成0.217 6 mg/mL 的羥苯乙酯貯備液。

1.3.2 大蒜辣素對照溶液 參考文獻［19］，制備得到564.74 μg/mL 的大蒜辣素溶液。

1.4 色譜條件 Waters Acquity BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相乙腈-0.1%甲酸水；體積流量0.3 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長242 nm；進樣量1 μL。

1.5 供試品溶液制備 稱取2 g 新鮮蒜泥，35 ℃水浴鍋放置30 min，先加入10 mL 超純水低溫超聲提取15 min，隨后加10 mL 甲醇再低溫超聲提取15 min，將超聲后的溶液和0.5 mL 的羥苯乙酯定容于5 mL 量瓶中待測。

1.6 色譜條件優化

1.6.1 檢測波長 分別對大蒜辣素、羥苯乙酯對照品溶液進行PDA 光譜掃描，得到光譜圖。在波長為210 nm 左右時，2 種化合物的紫外吸收都較大，但波長較低時同樣會使樣品中雜質的紫外吸收變大，鑒于羥苯乙酯濃度可控，因此以大蒜辣素有較優響應為目的，選擇大蒜辣素的特征肩峰242 nm 為檢測波長。

1.6.2 流動相 分別選用乙腈與水、甲醇與水、乙腈與甲酸水溶液為流動相，進行測試。結果表明，當以乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相時，分離效果相對較好，且分析時間較短。在該色譜條件下，大蒜辣素和羥苯乙酯在4 min 內實現基線分離，分離度均大于1.5。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 線性關系考察 將“1.3”項下對照品貯備液逐級稀釋，按濃度由低到高，在“1.4”項色譜條件下依次進樣，以峰面積為縱坐標（Y），質量濃度為橫坐標（X）進行回歸，結果見表1，表明各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.1.2 重復性試驗 取供試品6 份，按“1.5”項下方法制備供試品溶液，在“1.4”項色譜條件下進樣，測得大蒜辣素、羥苯乙酯峰面積RSD 均不大于1.00%，表明該方法重復性良好。

2.1.3 穩定性試驗 取同一混合供試品溶液，在“1.4”項色譜條件下，分別于第0、2、4、6、8、10、12 h 進樣，記錄峰面積。結果表明樣品溶液中大蒜辣素不穩定，其在0～4 h 內峰面積RSD 小于2.00%，之后出現明顯降解，羥苯乙酯穩定性較好，12 h 內峰面積RSD 0.65%。

2.1.4 加樣回收率試驗 取供試品按“1.5”項下方法制備供試品溶液，分別向鮮蒜供試品溶液中添加低、中、高3 個濃度水平的大蒜辣素對照溶液，在“1.4”項色譜條件下進樣測定，計算得大蒜辣素加樣回收率98.83%～100.88%，RSD 遠小于15%。

表2 各成分相對校正因子（n=5）Tab.2 Relative correction factors of various constituents（n=5）

2.3 相對校正因子耐用性考察 考察色譜條件的輕微變動對2 種化合物相對校正因子的影響，見表3。結果表明，除檢測波長外，其余考察因素的輕微變動對相對校正因子的RSD＜5%。

2.4 相對保留時間校正因子測定 考察色譜條件的輕微變動對相對保留時間校正因子的影響，見表4。結果表明羥苯乙酯對大蒜辣素的相對保留時間為1.49，RSD 為2.27%，故本研究選用相對保留時間作為目標色譜峰的定位指標。

2.5 樣品含有量測定 分別以外標法和替代對照品法測定15 個不同產地的新鮮大蒜中大蒜辣素的含有量，結果見表5，將2 種方法的測定結果進行單因素方差分析，分析結果表明，2 種方法測定結果無統計學差異（P＞0.05），且新疆產的大蒜中大蒜辣素含有量普遍高于內地大蒜，其中新疆且末、巴里坤地區的大蒜中大蒜辣素含有量最高。

表3 相對校正因子耐用性考察結果（n=5）Tab.3 Durability results of relative correction factor（n=5）

表4 不同色譜柱、檢測波長、體積流量、pH、柱溫下相對保留時間（n=5）Tab.4 Relative retention time under different columns，detection wavelength，flow rate，pH and column temperature（n=5）

表5 不同產地樣品中大蒜辣素含有量測定結果（n=3）Tab.5 Results of content determination of allicin in samples from different growing areas（n=3）

3 結論

本實驗首次建立了一種UPLC 替代對照品法測定鮮蒜中大蒜辣素的方法。該方法樣品前處理簡單，結果準確可靠，與已報道的HPLC 法相比，極大縮短了樣品測定時間，能在4 min 內完成樣品測定，有利于對不穩定的大蒜辣素快速檢測，與文獻［20］報道的UPLC 法相比，該方法不需要大蒜辣素對照品，解決了因大蒜辣素對照品不穩定而測定困難的問題。分別采用外標法和替代對照品法測定了15 個不同產地的鮮蒜中大蒜辣素的含有量，結果表明，2 種方法測得結果無統計學差異（P＞0.05），且新疆產的大蒜中大蒜辣素含有量普遍高于內地大蒜，其中新疆且末、巴里坤的大蒜中大蒜辣素含有量最高。