狗脊炮制工藝優(yōu)選及色度值測定

干 麗，鐘如帆，魏 梅，嚴(yán)玉晶，黃貴發(fā)，曾昭君

（廣東一方制藥有限公司，廣東 佛山 528244）

狗脊為蚌殼蕨科植物金毛狗脊Cibotium barometz（L.）J.Sm.的干燥根莖，具有祛風(fēng)濕、補肝腎、強腰膝的功效。傳統(tǒng)炮制理論和現(xiàn)代藥理研究均認為“生狗脊以祛風(fēng)濕、利關(guān)節(jié)為主，制品以補肝腎、強腰膝為主”［1］。2015 年版《中國藥典》［2］記載狗脊飲片分為生狗脊片、熟狗脊片、燙狗脊片，并要求燙狗脊的原兒茶酸含有量不得少于0.02%，規(guī)定其性狀“形如狗脊片，表面略鼓起，棕褐色”，但顏色描述為感官判斷，存在不準(zhǔn)確性和主觀性；而熟狗脊無性狀和含有量要求，不利于飲片質(zhì)量的控制。

目前，狗脊飲片研究較多的成分有原兒茶酸、原兒茶醛、5-羥甲基糠醛。研究表明，原兒茶酸具有抗炎、抗氧化、保護神經(jīng)元等藥理作用［3-5］；原兒茶醛具有抗動脈粥樣硬化、抗骨代謝、促骨合成等作用［6］。因此，選擇原兒茶酸和原兒茶醛為指標(biāo)成分對炮制時間進行優(yōu)選。5-羥甲基糠醛具有抗氧化、抗組織缺血［7-8］等藥理作用，但同時也具有刺激性、腎毒性［9-10］等不良反應(yīng)，基于用藥安全考慮，應(yīng)對炮制過程中5-羥甲基糠醛的含有量進行考察。

本研究通過對狗脊炮制過程中指標(biāo)成分含有量和樣品外觀顏色色度值的測定，考察含有量、色度值與炮制程度的相關(guān)性，按照優(yōu)選的炮制工藝，獲得基準(zhǔn)炮制品，確定各炮制品與基準(zhǔn)炮制品的最大色差值，以期為狗脊不同炮制品的炮制過程監(jiān)測及質(zhì)量評價提供參考。

1 材料

H22-X3 型電陶爐（杭州九陽生活電器有限公司）；AR852B+型紅外測溫儀（東莞萬創(chuàng)電子制品有限公司）；HP-C220 型精密色差儀（漢譜光彩科技有限公司）；ME204E 型分析天平（萬分之一，瑞士Mettler Toledo 公司）；e2695 型Waters 高效液相色譜儀（美國Waters 公司）。

狗脊藥材產(chǎn)于廣東、廣西，經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定為蚌殼蕨科植物金毛狗脊Cibotium barometz（L.）J.Sm.的干燥根莖。信息見表1。5-羥甲基糠醛（批號111626-201711，純度99.4%）、原兒茶酸（批號110809-200604，純度100%）、原兒茶醛（批號110810-200205，純度100%）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 含有量測定

2.1.1 色譜條件［1］Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相乙腈-1% 冰醋酸（5∶95）溶液；體積流量0.8 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長260 nm；進樣量10 μL。

2.1.2 對照品溶液制備 取5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、原兒茶醛對照品適量，精密稱定，加甲醇-1%冰醋酸溶液（70∶30）制成每1 mL 約含30 μg 5-羥甲基糠醛、90 μg 原兒茶酸、100 μg 原兒茶醛的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液制備 取藥材粉末（過3 號篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-1%冰醋酸溶液（70∶30）25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（250 W，40 kHz）30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇-1%冰醋酸溶液（70∶30）補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

2.1.4 專屬性試驗 吸取“2.1.2”“2.1.3”項下對照品、供試品溶液和陰性對照溶液，分別注入液相色譜儀進行測定。結(jié)果表明，陰性對照溶液在對照品溶液色譜峰相應(yīng)位置無吸收，陰性對照無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.5 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.1.2”項下混合對照品溶液1、2、4、6、8、10 mL 置10 mL量瓶中，加甲醇-1%冰醋酸稀釋至刻度，分別吸取上述混合對照品溶液各10 μL，在“2.1.1”項條件下進樣，記錄色譜峰面積，以進樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進行回歸，結(jié)果見表2，表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.1.6 精密度試驗 精密吸取“2.1.2”項下混合對照品溶液10 μL，在“2.1.1”項條件下連續(xù)進樣5 次，測得5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、原兒茶醛峰面積RSD 分別為0.888%、0.178%、0.958%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗 取同一批號的狗脊藥材按“2.1.3”項下方法平行制備供試品溶液6 份，在“2.1.1”項條件下進樣，測得5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、原兒茶醛含有量RSD 分別為1.554%、1.324%、1.022%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，在“2.1.1”項條件下，分別于0、2、4、6、8、10、12 h 進樣，測得原兒茶酸、5-羥甲基糠醛、原兒茶醛峰面積RSD 分別為0.200%、0.295%、0.113%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗 取已測定含有量的燙狗脊飲片9 份，精密稱定，每組3 份，按對照品加入量與所取供試品中待測定成分量之比0.5∶1、1∶1、1.5∶1 加入原兒茶酸、原兒茶醛、5-羥甲基糠醛對照品，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項條件下測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗結(jié)果（n=9）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n=9）

2.2 狗脊飲片粉末色度值測定 Lab 模式是由國際照明委員會（CIE）于1976 年公布的一種色彩模式，是CIE 組織確定的一個理論上包括了人眼可見的所有色彩的色彩模式，L 值表示物體明暗程度，a 值與b 值表示物體的顏色［11］。

2.2.1 測定方法 取狗脊飲片，粉碎，90%以上過3 號篩，無法過篩粉末與已過篩粉末混合。采用色差儀測定色度值，儀器校正后將各樣品粉末分別壓制于載玻片上，壓制厚度約為1 mm，測定飲片粉末的色度值（L、a、b），平行3 次，取平均值。

2.2.2 精密度試驗 取同一狗脊飲片粉末，按“2.2.1”項下方法連續(xù)測定6 次，測得RSD 均小于5.0%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性考察 取同一狗脊飲片粉末，按“2.2.1”項下方法分別于0、2、4、6、8、12 h 測定，測得RSD 均小于5.0%，表明樣品在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4 重復(fù)性考察 分別制備6 份粉末，按“2.2.1”項下方法測定色度值，測得RSD 均小于5.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3 飲片制備

2.3.1 熟狗脊飲片 參照2015 年版《中國藥典》四部0213 炮制通則，取大小、厚薄均勻的生狗脊片，加適量清水潤透，置蒸制容器內(nèi)，用蒸氣加熱，間隔一定時間，取出蒸狗脊飲片，稍晾，置于50 ℃烘箱中烘干。

2.3.2 燙狗脊飲片 參照2015 年版《中國藥典》四部0213 炮制通則，取潔凈河砂置炒制容器內(nèi)，設(shè)置電陶爐加熱功率1 200 W，加熱至河砂為滑利狀態(tài)，紅外測溫儀測定河砂溫度200 ℃，投入大小、厚薄均勻的生狗脊片，不斷翻動，間隔一定時間，取出燙狗脊飲片，篩去河砂，放涼，除去殘存絨毛。

2.4 含有量與色度值測定 分別按“2.1”“2.2”項下方法測定燙狗脊、熟狗脊飲片的含有量和色度值，結(jié)果見表4～5、圖2～3。

表4 熟狗脊蒸制過程中各成分含有量及飲片色度值測定結(jié)果Tab.4 Results of content determination of various constituents and chromaticity value of C.barometz during steaming process

表5 燙狗脊砂燙過程中各成分含有量及飲片色度值測定結(jié)果Tab.5 Results of content determination of various constituents and chromaticity value of C.barometz during stir-frying process

圖2 熟狗脊蒸制過程中飲片色度值變化Fig.2 Chromaticity value changes of C.barometz during steaming process

圖3 燙狗脊砂燙過程中飲片色度值變化Fig.3 Chromaticity value changes of C.barometz during stir-frying process

結(jié)果表明，狗脊砂燙和蒸制過程中，隨炮制時間延長，5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、原兒茶醛的含有量均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，表明3 種成分在炮制中均存在雙向轉(zhuǎn)化。狗脊飲片的色度值L值逐漸降低，a 值逐漸升高，且色度值的變化幅度基本一致，但b 值無明顯的變化規(guī)律。

2.5 綜合評分法優(yōu)選狗脊炮制時間 根據(jù)文獻［12］，以原兒茶酸和原兒茶醛的含有量為評價指標(biāo)，在數(shù)據(jù)處理時引用綜合指標(biāo)“隸屬度”，即指標(biāo)隸屬度＝（指標(biāo)值-指標(biāo)最小值）/（指標(biāo)最大值-指標(biāo)最小值）；綜合評分值＝原兒茶酸隸屬度×0.5+原兒茶醛隸屬度×0.5，計算各樣品的綜合評分值。結(jié)果見表6～7。

表6 熟狗脊樣品綜合評分Tab.6 Comprehensive scores of steamed C.barometz samples

表7 燙狗脊樣品綜合評分Tab.7 Comprehensive scores of stir-fryed C.barometz samples

由表6 可知，熟狗脊蒸制6 h 時，綜合評分值最大為1.00；由表7 可知，燙狗脊炒制24 min 時，綜合評分值最大為0.94。因此，熟狗脊的最佳蒸制時間為6 h；燙狗脊的最佳炒制時間為24 min。

2.6 成分含有量與色度值相關(guān)性分析 利用SPSS 20.0 軟件對熟狗脊（蒸制時間0～6 h）、燙狗脊（砂燙時間0～39 min）飲片3 種成分與其色度值進行Pearson 相關(guān)性分析，以各成分的含有量為自變量（X），色度值（L、a）為因變量（Y），進行線性回歸，結(jié)果見表8～9。

表8 狗脊飲片蒸制過程中各成分含有量與飲片色度值相關(guān)性Tab.8 Correlation between the content of various constituents and chromaticity values of C.barometz during steaming process

表9 狗脊飲片砂燙過程中各成分含有量與飲片色度值相關(guān)性Tab.9 Correlation between the content of various constituents and chromaticity values of C.barometz during stir-frying process

相關(guān)性分析結(jié)果表明，以上各組方差分析的顯著性值均小于0.01，表明建立的線性關(guān)系回歸模型具有極顯著的統(tǒng)計學(xué)意義。調(diào)整R 方均大于0.8，表明5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、原兒茶醛含有量與色度值有較強或極強的相關(guān)性，初步判斷模型擬合度較好。在3 種成分含有量上升階段，色度值a 與含有量呈正相關(guān)，當(dāng)含有量達最高值后，隨著炮制程度的進一步加深，含有量降低，色度值a與含有量呈負相關(guān)；色度值L 值反之。

2.7 色度值波動范圍確定 Lab 色彩理論系統(tǒng)中，樣品顏色總色值（E）表達，公式為E＝（L2+a2+b2）1/2，樣品的顏色變化色差（ΔE）＝（ΔL2+Δa2+Δb2）1/2，色差越大表示樣品與對照樣品色值相差越大，其值為6～12 個色差單位時，其色差可被人眼識別［13］。

按照綜合評分法優(yōu)選的炮制工藝對收集的10批樣品進行炮制，按“2.2”項下方法測定飲片的色度值；取各炮制品約2 g，以等量遞增法等量混合，得到混合樣品，以該混合樣品作為“基準(zhǔn)炮制品”，測定其色度值，并計算10 批炮制品同基準(zhǔn)炮制品的色差，結(jié)果見表10～11。

表10 10 批熟狗脊色度值與基準(zhǔn)炮制品的色差Tab.10 Chromatic aberration between the steaming products and standard products

表11 10 批燙狗脊色度值與基準(zhǔn)炮制品的色差Tab.11 Chromatic aberration between the stir-frying products and standard products

根據(jù)10 批炮制品混合樣品得基準(zhǔn)炮制品，各炮制品與基準(zhǔn)炮制品的最大色差值即為所允許的色差波動范圍，熟狗脊基準(zhǔn)炮制品色度值E熟狗脊為L＝42，a＝16，b＝34，允許的熟狗脊最大色差ΔE熟狗脊為3.6；燙狗脊基準(zhǔn)炮制品色度值E燙狗脊為L＝32，a＝15，b＝31，允許的燙狗脊最大色差ΔE燙狗脊為4.1。

3 討論

原兒茶酸-3-O-糖苷在狗脊生品中普遍存在，在加熱和酸性條件下，分解為原兒茶酸和糖［14］。炮制后原兒茶酸、原兒茶醛含有量增加，有利于增強狗脊抗炎、鎮(zhèn)痛、活血作用，祛風(fēng)濕作用，故本研究以該2 種成分含有量為指標(biāo)，采用綜合評分法對熟狗脊、燙狗脊的炮制時間進行優(yōu)選，保證藥品的有效性；狗脊中的葡萄糖、果糖等單糖化合物在高溫或弱酸條件下發(fā)生脫水反應(yīng)，生成5-羥甲基糠醛，隨著炮制加深，5-羥甲基糠醛進一步分解為甲酸和乙酰丙酸［15］，5-羥甲基糠醛具有抗氧化、抗組織缺血等作用，還有刺激性、腎毒性等嚴(yán)重不良反應(yīng)，2015 年版《中國藥典》對葡萄糖注射液的質(zhì)量檢測中，5-羥甲基糠醛被當(dāng)作有害物質(zhì)加以限量控制［16］，由于5-羥甲基糠醛在砂燙中含有量增加的幅度遠高于蒸制，比原藥材分別增加68.9、7.2 倍，基于用藥的安全考慮，建議對5-羥甲基糠醛的含有量做限度規(guī)定，具體限度有賴于結(jié)合進一步藥理學(xué)研究結(jié)果確定。

炮制過程中飲片粉末顏色加深，由黃色逐漸變?yōu)樯钭厣秃稚琇 值數(shù)值減小，a 值增大，顏色的加深可能與其所含的羰基化合物（糖類成分）和氨基化合物（氨基酸和蛋白質(zhì)）在炮制過程中發(fā)生的梅拉德反應(yīng)有關(guān)，最終生成深棕色或黑色的物質(zhì)［17］。飲片色度值的變化與含有量有較強的相關(guān)性，可在一定程度上反映飲片的炮制程度，因此，本實驗在研究含有量與色度值的相關(guān)性的基礎(chǔ)上，按照最佳炮制工藝進一步制備基準(zhǔn)炮制品，炮制品與基準(zhǔn)炮制品的最大色差值，即允許的色差波動范圍，可作為在線監(jiān)控狗脊飲片炮制程度的指標(biāo)之一，以便快速、客觀地評價炮制品質(zhì)量。