海人樹莖化學成分及抗氧化活性

羊 青，王茂媛，王清隆，李英英，晏小霞，湯 歡，王建榮，王祝年

（1.中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所，海南 海口 571101；2.農業農村部華南作物基因資源與種質創制重點開放實驗室，海南 海口 571101；3.農業農村部熱帶農業野生植物基因資源鑒定評價中心，海南 儋州 571737）

海人樹Suriana maritimaLinnaeus 為苦木科海人樹屬常綠灌木或小喬木［1］，在我國，海人樹目前僅分布于西沙群島的少數島嶼，種群及個體數均很少，急需保護，已有學者對其保護遺傳學進行了研究［2-3］，但是對海人樹化學成分研究的報道并不多見，其含有烷烴類、谷甾醇、木質素、蘆丁、黃酮醇苷等成分［4-5］，然而研究不夠系統和全面，且目前國內尚無有關海人樹化學成分和藥理活性研究的報道。苦木科植物如鴉膽子、苦木、牛筋果、臭椿等常因具有特殊的化學成分和優異的生物活性而被報道，如鴉膽子中含有苦木素類，具有抗腫瘤、抗炎、抗寄生蟲、抗病毒、抗菌、降血糖等多種藥理活性［6-8］；苦木中含有4，5-二甲氧基-鐵屎米酮等多種生物堿，具有清熱、解毒、降壓、抗炎、抗氧化、抗瘧疾、抗腫瘤等作用［9-11］；牛筋果中含有色原酮類、苦木素類、聚酮類、三萜類等有效成分，具有抗腫瘤、抗瘧、抗氧化、昆蟲拒食活性等多種藥理活性［12-14］；臭椿中含有生物堿類、苦木苦味素類、萜類、甾醇等多種成分，在殺蟲、抗病毒、抑制病原菌、除草等方面有顯著作用［15-16］。因此，作為苦木科植物中的一種，海人樹的化學成分及其生物活性值得深入研究。

本實驗采用UPLC-Q/TOF-MS 技術對海人樹莖提取物進行分析，采用電噴霧離子源（ESI），在正負離子模式下掃描采集數據，利用UNIFI 科學信息系統，結合相關文獻數據，對各主要色譜峰進行歸屬，快速定性其主要化學成分，以期為其藥效物質基礎的闡明提供參考；采用DPPH 法和ABTS 法對海人樹莖提取物的抗氧化活性進行研究，以期為其資源保護利用提供依據。

1 材料

1.1 儀器 Xevo G2-XS QTof 液質聯用儀包括ACQUITY UPLC?I-Class 系統，Xevo G2-XS QTof 質譜儀（美國Waters 公司）；ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm 1.8 μm，美國Waters 公司）；Secura513-1CN 精密天平（德國Sartorius 公司）；Milli-Q 超純水儀（德國Merck Millipore 公司）；5810R 臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf Centrifuge 公司）；UV-2100 紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；HLB 固相微萃取柱（美國Waters 公司）；Pall GHPAcrodisc?Syringe 濾膜（美國Pall 公司）；一次性無菌注射器帶針（豐臨醫療器械有限公司）；Labmed 移液槍頭（美國Labmed Biotech 公司）；KG2 211 W 1.5 mL 離心管（美國Kirgen 公司）；2 mL 透明螺口蓋樣品瓶（美國Waters 公司）。。

1.2 試劑與藥物 甲醇、乙腈（質譜級，純度≥99.99%，美國Fisher 公司）；甲酸（質譜級，純度98%～100%，德國Merck Millipore 公司）；氫氧化鈉（ACS 級，純度≥97%，美國Sigma 公司）；亮氨酸腦啡肽（美國Waters 公司）；DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，美國Sigma 公司）；ABTS（2，2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽，北京索萊寶科技有限公司）；過硫酸鉀（K2S2O8）、乙醇為分析純，購自上海國藥集團。蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；超純水由Milli-Q 超純水儀制備，其他試劑均為分析純。

1.3 樣品 供試樣品于2018 年6 月采自西沙群島，經中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所王祝年研究員鑒定為苦木科海人樹屬植物海人樹Suriana maritimaLinnaeus，取用海人樹的莖進行分析。

2 方法

2.1 供試品溶液制備 取適量原材料自然風干，粉碎后過80 目篩，精確稱取10 g 樣品，用200 mL 70%乙醇回流提取1 h，提取溫度70 ℃。取提取液1 mL，冷凍離心（12 000 r/min，10 min，10 ℃），靜置1～2 min，取上清液300 μL 過Waters HLB 固相微萃取柱，先用600 μL 5% 甲醇洗脫，再用500 μL 90%甲醇洗脫，收集90%甲醇洗脫液，過0.2 μm 微孔濾膜，存儲于2 mL 透明樣品瓶，標記HRS-stem，4 ℃冰箱保存備用。所有樣品現配現用，不得超過24 h 保存期。

2.2 UPLC/Q-TOF-MS 檢測條件

2.2.1 色譜條件 Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm 1.8 μm）；流動相0.1%甲酸水溶液（A）-0.01%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脫，程序見表1；體積流量0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量1 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2.2 質譜條件 電噴霧離子源（ESI）在正（+）、負離子（-）條件下，Continuum 模式，采集MSE數據。校正液為200 pg/μL 亮氨酸腦啡肽，0.5 mmol/mL 甲酸鈉。掃描范圍m/z50～1 200，掃描時間0.2 s，檢測時間20 min。低能量碰撞電壓（CE）6 V，高能量碰撞電壓20～60 V；正離子模式的毛細管電壓3.0 kV；負離子模式的毛細管電壓2.0 kV；錐孔電壓40 V；離子源溫度100 ℃；輔助噴霧電離與去溶劑氣體為高純度N2；去溶劑化溫度450 ℃；錐孔氣體流量50 L/h；去溶劑化氣體流量600 L/h。

2.2.3 數據處理 采用Masslynx V4.1 軟件采集、管理和簡單處理UPLC/Q Tof MSE數據；UNIFI 科學信息系統進行數據的瀏覽、存儲和綜合分析等。基于文獻報道數據，結合 TCM Chinese［UNIFI1.7］，ChemSpider 在線數據庫，進行化合物成分鑒定。

2.3 抗氧化活性測試

2.3.1 海人樹提取物對DPPH 自由基的清除能力 用無水乙醇將提取物配制成5 個質量濃度梯度，分別 為0.01、0.02、0.04、0.08、0.20 mg/mL。將DPPH 配制成6.5×10-5mol/L 溶液，在試管1 中加入2.95 mL DPPH 溶液及0.05 mL 無水乙醇，混勻；在試管2 中，加入2.95 mL DPPH 溶液及0.05 mL供試品溶液，混勻；在試管3 中加入2.95 mL無水乙醇及0.05 mL 供試品溶液，混勻；各試管在反應30 min 后，在517 nm 波長下測定吸光度值分別記為Ao、Ai、Aj。按上述方法配制各個梯度，每一吸光度均平行測定3 次，每一濃度梯度均測3 組，取其平均值代入下式計算相應的DPPH清除率，清除率（%）＝［1-（Ai-Aj）/Ao］×100。以DPPH 清除率為縱坐標，供試樣品溶液質量濃度為橫坐標得到待測樣品清除DPPH 自由基的關系曲線，并計算出DPPH 清除率達50% 時的樣品濃度，即半數清除率（IC50）［17］。

2.3.2 海人樹提取物對ABTS 自由基的清除能力 將等量的7 mmol/L ABTS 與2.45 mmol/L K2S2O8溶液混勻并于暗處反應16 h 制備得到ABTS+·。用乙醇將ABTS+·溶液稀釋至波長734 nm處吸光值為（0.70+0.02）。將不同質量濃度（0.01、0.02、0.04、0.08、0.20 mg/mL）的海人樹莖提取物50 μL 加入2.95 mL ABTS+·溶液中，混勻反應6 min并測其吸光值（Ax）。50 μL 乙醇與2.95 mL 的ABTS 與K2S2O8混合液反應后吸光值為A0。50 μL 不同濃度海人樹莖提取物與2.95 mL 乙醇溶液混合后吸光值為Ay。每組樣品重復3 次，以平均值按下列公式計算清除率，清除率（%）＝［1-（Ax-Ay）/A0］×100［18］。以ABTS 清除率為縱坐標，供試品溶液質量濃度為橫坐標得到待測樣品清除ABTS 自由基的關系曲線，并計算出ABTS 清除率達50%時的樣品濃度，即半數清除率（IC50）。

3 結果

3.1 成分分析 通過UPLC/Q-TOF-MS 對供試品化學成分的定性分析，其中（-）ESI-MS 質譜總離子流圖的分離度較好，響應較高，見圖1。因此，以負離子數據導入UNIFI 對海人樹莖提取物進行化學成分鑒定，結果見表2，結構圖見圖2～3。

圖1 海人樹莖提取物負離子模式下總離子流和基峰圖Fig.1 Total ion chromatogram and base peak chromatograms with negative ion mode of extraction from the stems of S.maritime

根據質譜給出的精確相對分子質量、質譜碎片，誤差范圍±6×10-6左右，結合文獻及在線數據庫匹配結果推斷，鑒定了海人樹莖提取物中43 種成分，包括黃酮、酚酸、花青素和三萜皂苷等。

表2 海人樹莖化學成分UPLC-Q-TOF/MS 鑒定結果Tab.2 Identification of the chemical constituents from the stems of S.maritime by UPLC-Q-TOF/MS

續表2

圖2 海人樹莖中黃酮類、酚酸類、花青素類化合物結構Fig.2 Structure of flavonoids，phenolic acids，anthocyanins，from extraction of the stems of S.maritime

圖3 海人樹莖提取物其他化合物結構Fig.3 Structures of other compounds from extraction of the stems of S.maritime

3.2 抗氧化活性 分別采用DPPH 法和ABTS 法測定海人樹莖的抗氧化活性，以抗壞血酸為對照。從測定結果可知，海人樹莖提取物對DPPH 和ABTS 自由基有明顯的清除作用，且提取物濃度與清除率間呈正相關，隨著提取物濃度的逐漸增大，清除率逐步增大。經線性分析可知，海人樹莖提取物濃度（X）與DPPH 自由基清除率（Y）的回歸方程為Y＝367.23X+9.525 5（r＝0.967 9），對照抗壞血酸的回歸方程為Y＝173.38X-1.238 5（r＝0.999 8）。海人樹莖和抗壞血酸對DPPH 自由基清除作用的IC50值分別為0.110 2、0.295 5 mg/mL；海人樹莖提取物濃度（X）與ABTS 自由基清除率（Y）的回歸方程為Y＝429.65X+8.796 8（r＝0.983 6），對照抗壞血酸的回歸方程為Y＝487.58X+4.309 2（r＝0.991 3）。海人樹莖和抗壞血酸對ABTS 自由基清除作用的IC50值分別為0.095 9、0.093 8 mg/mL。

4 討論

本實驗首次利用UPLC-Q-TOF-MS 技術對海人樹莖提取物成分進行快速、全面地定性分析，采用電噴霧離子源（ESI），在正負離子模式下掃描采集數據，共分析鑒定得到43 個化合物，其中包括6 個黃酮類、10 個酚酸類、13 個花青素類、3 個長鏈脂肪酸類、11 個三萜皂苷類。研究結果表明，樣品主要成分為黃酮、花青素、三萜皂苷類。各成分特征性非常強，尤其是花青素類，是原花青素的二聚體、三聚體、四聚體，也充分證實了樣品屬于莖類原料，因此富含鞣質類。其次，也分析鑒定出大量的三萜皂苷類成分，其皂苷苷元包括齊墩果烷型和熊果酸型，是海人樹莖提取物又一類特征成分。

海人樹莖提取物對DPPH 和ABTS 自由基清除能力的研究發現，提取物濃度與清除率間呈正相關，隨著提取物濃度的逐漸增大，清除率逐步增大。海人樹莖對DPPH 自由基的清除能力顯著高于對照抗壞血酸，對ABTS 自由基的清除能力與抗壞血酸基本一樣，研究結果表明海人樹莖提取物具有很強的抗氧化活性，這可能與其含有豐富的黃酮類成分，尤其是花青素類成分密切相關，其他生物活性有待進一步研究。海人樹莖提取物的化學成分和抗氧化活性研究，以期為其藥效物質基礎研究及資源利用提供參考。