黃芩中3 種黃酮水熱法提取工藝的優化

李 杰，尚孟文，李婼楠，吳艷芳

（河南科技大學醫學院，河南 洛陽 471023）

黃芩為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi 的干燥根，其味苦，性寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血等功效，主要活性成分是以黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素為代表的黃酮類物質，有著抗氧化、抗腫瘤、抗纖維化等多種生物活性［1］。目前，用于提取黃芩中上述黃酮的溶劑主要有水［2］、甲醇［3］、乙醇［4］、離子液體［5］，其中水提符合中藥傳統使用方法，其廉價易得、無毒、無污染，但產物得率低，能耗高，會造成資源浪費，故建立一種環保、高效、簡便的提取工藝具有一定現實意義。

水熱法提取具有綠色環保、操作簡便等優點，該方法主要是利用一定的水熱溫度和壓力來使植物細胞壁裂解或水解，減小溶劑滲透、擴散到細胞內部的阻力，從而使細胞內的天然產物活性組分能高效、快速的溶出。王星敏等［6］應用水熱法提取桑葉中異槲皮苷，發現它可加快木脂素中苯丙基C-O-C、C＝C 結構的分解，提高了該成分得率；Sato 等［7］將其應用于咖啡生豆中抗氧化物質的提取，發現提取液可用于保健品、運動飲料；Gao 等［8］通過上述方法提取種茶108 中的多糖，發現它不會影響該成分生物活性，另外該技術還可用于β-葡聚糖［9］、蘋果酸［10］、半纖維素［11］等天然活性物質的提取，顯示出廣闊的應用前景。但目前關于水熱法在中藥材活性物質提取方面的研究還鮮見報道，故本實驗采用該方法提取黃芩中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素3 種黃酮類物質，并對其進行優化，以期為其他中藥材有效成分的提取提供新思路。

1 材料

LC2000 液相色譜儀（上海天美科學儀器有限公司）；ELx800 酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；BT125D 雙量程電子分析天平（德國賽多利斯公司）；KQ2200D 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CT14RD 高速離心機（上海天美生化儀器設備有限公司）；聚四氟乙烯內襯、不銹鋼反應釜（鄭州博科儀器設備有限公司）；PHG9246A 電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）。黃芩（洛陽同仁堂藥店）經河南科技大學李艷教授鑒定為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi 的干燥根。黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素對照品（國家標準物質中心）；甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純（天津市科密歐化學試劑有限公司）；水為純凈水（杭州娃哈哈集團公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Kromasil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）；體積流量1.0 mL/min；柱溫室溫；檢測波長275 nm；進樣量20 μL。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取黃芩苷、漢黃芩苷對照品6.0 mg，黃芩素對照品5.0 mg，置于10 mL 量瓶中，50%甲醇溶解，分別移取5、2.5、2.5 mL 至25 mL 量瓶中，50%甲醇定容，得到貯備液，精密吸取1.0、1.5、2、2.5、3 mL 于10 mL 量瓶中，50%甲醇定容，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.3 供試品溶液制備 取藥材粉末1.0 g（過60 目篩）、純凈水40 mL，一同置于聚四氟乙烯內襯的反應釜內，攪拌均勻后密封，在110 ℃下提取15 min，取出，自然冷卻至室溫，移取提取液2 mL 至離心管中，10 000 r/min 離心5 min，取1 mL 上清液于100 mL 量瓶中，50% 甲醇定容，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.4 線性關系考察 取對照品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以溶液質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系

2.5 專屬性試驗 取對照品、供試品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，2種溶液中各成分在相同保留時間處均有吸收，分離度大于1.5，理論塔板數大于6 000，峰形對稱，雜質峰對檢測無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.6 方法學考察 取對照品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下進樣測定5 次，測得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素峰面積RSD 分別為1.22%、0.96%、1.31%，表明儀器精密度良好。取供試品溶液適量，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得3 種黃酮峰面積RSD分別為1.09%、1.12%、1.26%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。平行制備5 份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得3 種黃酮含有量RSD 分別為2.04%、1.83%、1.74%，表明該方法重復性良好。同時，3 種黃酮平均加樣回收率分別為99.5%、103.1%、98.3%，RSD 分別為2.1%、2.9%、3.6%。

2.7 總得率測定 按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.4”項下方法計算3 種黃酮含有量，測定總得率Y，公式為Y＝（C1+C2+C3）×V×N/（M×1 000），其中C1、C2、C3分別為黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素含有量（μg/mL），V為提取溶劑體積（mL），N為稀釋倍數（倍），M為藥材質量（g）。

2.8 單因素試驗

2.8.1 液料比 固定提取溫度110 ℃、提取時間15 min，考察液料比對3 種黃酮總得率的影響，結果見圖2。由此可知，總得率隨液料比增加而逐漸升高，在40∶1 時達到最大值，這是因為液料比增加在一定程度上提高了提取體系內的壓力與固液之間的接觸面積，并且壓力升高有利于植物細胞壁破碎［12］，而且接觸面積增加可擴大固液間黃酮濃度差［13］，兩者協同作用使黃酮能夠快速溶出，從而提高提取效率；超過40∶1 時總得率趨于穩定，但提取液中黃酮含有量反而降低，導致后續純化、濃縮成本增加。因此，選擇液料比為40∶1。

圖2 料液比對3 種黃酮總得率的影響

2.8.2 提取時間 固定提取溫度110 ℃、液料比40∶1，考察提取時間對3 種黃酮總得率的影響，結果見圖3。由此可知，提取時間超過15 min 后總得率開始降低，這是因為在水熱提取過程中纖維素、半纖維素的長鏈分子轉化為可溶性的低聚糖、單糖等小分子，木脂素轉化為較低分子的酚類單體或多聚體［6］，從而使植物細胞壁遭到破壞，有利于降低水分子進出細胞的阻力，促進黃酮溶出而提高其得率；但提取時間過長會導致黃酮結構發生變化或分解［14］，導致其得率反而降低。因此，選擇提取時間為15 min。

圖3 提取時間對3 種黃酮總得率的影響

2.8.3 提取溫度 固定液料比40∶1、提取時間15 min，考察提取溫度對3 種黃酮總得率的影響，結果見圖4。由此可知，隨著提取溫度增加總得率升高，在110 ℃時達到最大值，這是因為在此溫度下水由常態轉化為亞臨界態，其理化性質發生了突變，如水分子極性和水分子簇變小、介電常數降低等，有利于提高黃酮在水中的溶解性和水分子進出細胞的交換速率［15］，同時溫度升高也可使提取體系內的自生壓力增加，有助于細胞壁破裂、黃酮溶出；但超過110 ℃時總得率反而降低，可能是由于溫度過高導致溶出的黃酮分解。因此，選擇提取溫度為110 ℃。

圖4 提取溫度對3 種黃酮總得率的影響

2.9 響應面法 在單因素試驗的基礎上，以液料比（A）、提取時間（B）、提取溫度（C）為影響因素，3 種黃酮總得率（Y）為評價指標，通過Design-Expert 8.0.6.1 軟件設計三因素五水平試驗，優化水熱法提取工藝。因素水平見表2，結果見表3。

表2 因素水平

表3 試驗設計與結果

通過Design-Expert 8.0.6.1 軟件對表3 數據進行擬合，得到二元多項回歸方程為Y＝163.10+5.39A-4.71B+9.808C+21.24AB-8.39AC+5.14BC-24.23A2-20.06B2-16.52C2，方差分析見表4。由此可知，模型具有高度顯著性（P＜0.000 1）；失擬項F值為3.32，P＝0.107 2＞0.05，表明模型可較好地描述各因素與響應值之間的關系；決定系數R2、校正系數分別為0.983 8、0.969 2，表明模型擬合度良好，可信度較高，可用于分析預測［16］；變異系數為4.92%，表明模型具有理想的精密度和可靠性［17］；各因素及其二次項、交互項均有顯著影響（P＜0.05），表明它們之間不是簡單的線性關系，影響程度依次為C（提取溫度）＞A（液料比）＞B（提取時間）。

表4 方差分析

由響應面分析可知AB交互效應最顯著，其次是AC，BC最弱，與表4 結果吻合，同時隨著各因素的增加，相應響應值先升后降。通過Design Expert 8.0.6.1 軟件進行分析，得到最優條件為液料比40.35∶1，提取時間14.68 min，提取溫度112.79 ℃，總得率165 mg/g。

為了方便操作，將優化工藝修正為提取溫度113 ℃，提取時間15 min，液料比40∶1，同時與文獻［18］報道的最優水煎煮工藝（提取時間50 min，液料比25∶1，提取次數2 次）進行比較，結果見表5。由此可知，本實驗所得工藝穩定可靠，而且水熱法提取效果優于水煎煮法，可能是由于水熱法是在較高溫度、壓力下進行的，可使植物細胞壁被充分破壞，減小了黃酮溶出阻力，從而使其得率增加。

響應面分析見圖5。

表5 驗證試驗結果（n=3）

3 討論與結論

圖5 各因素響應面圖

目前，提取黃芩中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素的常用溶劑主要為水、甲醇、乙醇、離子液體，其中水提存在時間長、得率低、能耗高等不足；甲醇提取有一定的毒性，與中藥綠色環保的理念相悖；乙醇提取雖然無毒，但其回收需蒸餾、分餾等操作，后處理較為繁瑣；離子液體提取制備過程繁瑣，成本高，難于工業化生產。鑒于此，本實驗對水熱法提取黃芩中上述3 種黃酮的可行性進行了研究，發現該方法提取效果較理想，通過響應面法優化得到最優工藝為液料比40∶1，提取時間15 min，提取溫度113 ℃，3 種黃酮總得率為161 mg/g，與預測值165 mg/g接近，表明該方法合理可靠，可有效減少操作隨機性和盲目性。