杜仲補天素膠囊對己烯雌酚誘導雄性小鼠生精障礙的實驗研究

闞玉璇 ，曾夢楠，張貝貝，李本科，劉 莉，馮衛生，鄭曉珂*

（1.河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046；2.呼吸疾病診療與新藥研發河南省協同創新中心，河南 鄭州 450046；3.貴州漢方藥業有限公司，貴州 貴陽 550014）

近年來，男性生殖障礙疾病的發病率逐漸上升，單純的遺傳缺陷已經無法解釋其高發病率現象，越來越多的證據表明環境或生活方式的因素才是導致發病率上升迅速的重要原因［1］。環境雌激素是環境中一類具有雌激素活性的內分泌干擾素，能夠導致雄性生殖能力降低、生精功能受損等多種生殖障礙［2］。而環境雌激素廣泛存在于人類和動物排泄物、植物性化合物以及塑料制品和殘留農藥中，其中人類和各種大型家畜排泄物中類固醇雌激素是城鎮和農村地表水的重要污染源。己烯雌酚（Diethylstilbestrol，DES）則是一種常見的環境雌激素，是人工合成的非甾體雌激素物質，研究表明，DES 能夠導致睪丸癌、尿道下裂、精子數量下降、受精能力降低等病癥［3-4］。DES 對雄性生殖系統不良影響的報道已有不少，其也是制備生精障礙常用造模藥。杜仲補天素膠囊由二十余味中藥組成，氣微，味酸、微甘，具有溫腎養心、壯腰安神的功效，其中杜仲、菟絲子、肉蓯蓉等均有補腎益精的功效，臨床上多用于腰脊酸軟、神疲乏力等癥狀。中醫學認為腎為臟腑之本，十二經之根，先天之本在于腎［5］。《素問·上古天真論》曰：“腎氣盛，天癸至，精氣溢瀉，陰陽和，故能有子”［6-7］，生殖之精藏于腎，精的產生、成熟與腎息息相關。中醫認為“腎主生殖”，若腎精衰少、腎氣不足則無子。在傳統的中醫藥臨床應用及實驗均已證實：通過補腎治療后，生殖功能的確有所改善［8-9］。而具有補腎功能的杜仲補天素膠囊是否對小鼠生精障礙有改善作用未見報道，故本實驗的目的在于探究杜仲補天素膠囊對己烯雌酚誘導的雄性小鼠生精障礙的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級BALB/c 小鼠60 只，雄性，體質量18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK（京）2016-0006。

1.2 藥物與試劑 杜仲補天素膠囊、生精膠囊，均購自貴州漢方藥業有限公司（批號2558002、20180701）；己烯雌酚（批號OB913-1 g）購自九鼎化學科技有限公司；橄欖油（批號R002010-500 mL）購自上海百舜生物科技有限公司；雌二醇（E2）、睪酮（T）、促卵泡生成激素（FSH）、促黃體生成素（LH）試劑盒購自美國R＆D 公司；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）購自南京建成生物技術研究所；一抗TLR4、一抗MYD88 購自英國Abcam 公司；羊抗兔二抗（批號925-68071）購自美國LI-COR 公司。

1.3 儀器 BD FACS Aria III 流式細胞儀（美國BD 公司）；JFX-B 精子質量分析儀（石家莊華眾醫療用品有限公司）；Odessey 雙色紅外激光成像系統（美國LI-COR 公司）；TMC 恒溫孵育器（合肥艾本森科學儀器有限公司）；Centrifuge-5804R 小型高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；半干轉膜儀（美國BIO-RAD 公司）；微量加樣器（德國Eppendorf 公司）；WD-9405B 型水平搖床（北京市六一儀器廠）；DYY-24DN 電泳儀（北京市六一儀器廠）。

1.4 方法

1.4.1 分組與給藥 60 只雄性BALB/c 小鼠正常喂養7 d后，隨機分為6 組，正常組、溶劑對照組、DES 模型組、陽性藥生精膠囊組、杜仲補天素膠囊低劑量和高劑量組。生精膠囊和杜仲補天素膠囊均以0.5%羧甲基纖維素鈉為溶劑，生精膠囊組每只按照0.8 g/kg 灌胃給藥，杜仲補天素膠囊低劑量組和高劑量組分別按照0.347、1.388 g/kg 灌胃給藥，正常組灌胃等劑量的水、溶劑對照組和DES 模型組灌胃等劑量0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。4 h 后，DES 模型組、陽性藥組和杜仲補天素組腹腔注射40 mg/kg 以橄欖油為溶劑的DES，溶劑對照組分別腹腔注射等劑量橄欖油。連續7 d，末次注射后禁食24 h，取材。

1.4.2 臟器指數 小鼠眼球取血處死后，取心、肝、脾、肺、腎、睪丸、附睪稱重，計算各臟器系數。計算公式：臟器系數＝（各臟器質量/小鼠體質量）×100%。

1.4.3 睪丸、附睪組織切片觀察 取左側睪丸及附睪，浸于3.7%甲醛溶液固定，乙醇逐級脫水，石蠟包埋，切片厚5 mm，用蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學顯微鏡下觀察腎組織形態變化。

1.4.4 精子數量及活力檢測 取右側附睪于1.5 mL 離心管，加入500 μLPBS，剪碎，放置恒溫孵育器孵育10 min，使精子充分游離，再加入PBS 500 μL，用40 μm 濾膜過濾，取20 μL 精子懸液滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，置于精子質量分析儀檢測細胞活力。另取500 μL 精子懸液于離心管中，加入500 μL 5%的碳酸氫鈉溶液，搖勻，于計數板上計數。

1.4.5 性激素水平的檢測 取各組小鼠血液4 ℃離心，3 000 r/min，10 min；取上清于-80 ℃保存，備用。采用酶聯免疫法檢測血清中雌二醇（E2）、睪酮（T）、促卵泡生成激素（FSH）、促黃體生成素（LH）水平，具體操作按試劑盒說明書進行。

1.4.6 氧化應激指標的檢測 取右側腎組織，制成10%勻漿，采用硫代巴比妥酸法（TBA 法）檢測組中MDA 水平、羥胺法檢測SOD 水平、比色法檢測GSH-Px 水平，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.4.7 原代腎細胞凋亡檢測 取新鮮左側腎組織，快速去除腎包膜剪碎，加入PBS 清洗，離心棄上清，重復清洗兩次。然后加入1 mL 胰酶消化，3 min 后立即加入胎牛血清終止消化，用70 μm 濾網過濾，收集濾液，1 500 r/min 離心5 min，棄上清得原代細胞，各加入100 μL 1x Binding Buffer，轉移至流式管。通過AnnexinV-PE/7-AAD 方法檢測并分析細胞凋亡情況。

1.4.8 原代腎細胞ROS 檢測 原代腎細胞提取同“1.4.7”項。按照ROS 檢測試劑盒說明書配制樣本，流式細胞儀檢測并分析細胞ROS 水平變化

1.4.9 蛋白印跡法檢測腎臟中TLR4、MyD88 蛋白的表達 取腎臟組織，按照總蛋白提取試劑盒操作，提取各組小鼠腎臟總蛋白，用BCA 蛋白定量試劑盒測定總蛋白濃度，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）將蛋白按照相對分子質量的大小分離成不同的條帶，將內參蛋白和目的蛋白轉移到PVDF 膜上，用5% 的脫脂奶粉于搖床封閉1 h，加入一抗TLR4（1∶500）、MyD88（1∶200）和兔源內參蛋白β-actin（1∶1 000），室溫孵育0.5 h 后，4 ℃冰箱孵育過夜，用PBST 洗滌5 次，每次5 min，加入二抗（1∶20000），室溫避光孵育1 h，再次用PBST 洗滌，用Odyssey 雙色紅外激光成像系統進行掃描分析。

2 結果

2.1 杜仲補天素膠囊對生精障礙小鼠睪丸病理形態的影響 正常生理狀況下，小鼠曲細精管排列緊湊，形態清晰，各級生精細胞層次分明，管腔內充滿大量發育成熟的精子（圖1 A）；己烯雌酚則可以使小鼠的曲細精管間隙增大，細胞排列疏松，生精細胞層次不明且數量減少（圖1C）。生精膠囊組（圖1D）小鼠曲細精管結構與正常組接近，各級生精細胞排列有序且數量增多。給藥杜仲補天素膠囊之后，小鼠曲細精管間隙減小，細胞排列稍緊密，高劑量尤為突出（圖1E～F）。

2.2 杜仲補天素膠囊對生精障礙小鼠睪丸、附睪系數和精子的影響 精子數量與精子活力最能體現生殖功能，而睪丸及附睪則是精子主要產生和運輸的器官。如表1 所示，與正常組相比，己烯雌酚可以使小鼠睪丸系數降低（P＜0.05），精子數量和精子活力降低（P＜0.01），給藥后，與模型組相比，杜仲補天素低劑量組睪丸系數升高（P＜0.05），高劑量組和生精膠囊組升高（P＜0.01）；生精膠囊組和杜仲補天素膠囊高劑量組精子數量和精子活力均升高（P＜0.05，P＜0.01）。

圖1 杜仲補天素膠囊對生精障礙小鼠睪丸病理形態的影響（×200）

表1 杜仲補天素膠囊對生精障礙小鼠睪丸、附睪系數和精子的影響（，n=10）

表1 杜仲補天素膠囊對生精障礙小鼠睪丸、附睪系數和精子的影響（，n=10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.3 杜仲補天素膠囊對生精障礙小鼠臟器系數的影響 機體是一個有機的整體，五臟六腑在抵抗外來侵害時都發揮了重要作用，故本實驗對其他臟器系數進行了統計。結果如表2，與正常組相比，DES 模型組胸腺、脾臟系數降低（P＜0.01），腎臟系數降低（P＜0.05），肝臟系數升高（P＜0.01）。給藥后，生精膠囊組和杜仲補天素膠囊高劑量組腎臟系數以及高劑量組胸腺系數升高（P＜0.05），生精膠囊組和杜仲補天素膠囊高劑量組肝臟系數降低（P＜0.05）。

表2 杜仲補天素膠囊對生精障礙小鼠臟器系數的影響（，n=10）

表2 杜仲補天素膠囊對生精障礙小鼠臟器系數的影響（，n=10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.4 杜仲補天素膠囊對小鼠血清中性激素水平的影響 生殖功能的正常運轉離不開體內性激素的調節。ELISA 結果如表3 所示，與正常組相比，DES 模型組E2、T 水平降低（P＜0.05），FSH、LH 水平升高（P＜0.05）。給藥后，生精膠囊組E2 水平升高（P＜0.01），杜仲補天素膠囊高劑量組水平升高（P＜0.05）；生精膠囊組T 水平升高（P＜0.05），FSH 水平降低（P＜0.05）。

2.5 杜仲補天素膠囊對小鼠原代腎細胞凋亡的影響 正常數量的腎臟細胞是維持腎臟功能的必要保證，一旦腎臟細胞出現過度凋亡則會嚴重影響腎臟功能，流式細胞術則是檢測細胞凋亡的常用手段。結果如圖2 顯示，與正常組相比（3.1%），DES 模型組的細胞凋亡率升高（11.3%；P＜0.01），給藥后，生精膠囊組和杜仲補天素膠囊低、高劑量組細胞凋亡率均降低（8.3%、8.5%、7.0%；P＜0.05）。

2.6 杜仲補天素膠囊對小鼠腎臟組織中氧化應激指標的影響 正常狀態下，體內氧化系統和抗氧化系統處于動態平衡狀態。病理狀態時，體內會產生大量自由基，平衡被打破，機體將產生氧化應激反應。本實驗采用試劑盒檢測體內氧化系統MDA 以及抗氧化系統SOD 與GSH-Px 水平，結果如表4，與正常組相比，DES 模型組小鼠腎臟組織中MDA 水平升高（P＜0.01），GSH-Px 活性極顯著降低（P＜0.01）。給藥后，生精膠囊組小鼠腎臟組織中MDA 水平降低（P＜0.01），杜仲補天素膠囊高劑量組腎臟組中MDA 水平降低（P＜0.05）；生精膠囊組和杜仲補天素膠囊高劑量組腎臟組織中GSH-Px 活性升高（P＜0.01），低劑量組GSH-Px 活性顯著升高（P＜0.05）。

表3 杜仲補天素膠囊對小鼠血清中性激素水平的影響（，n=10）

表3 杜仲補天素膠囊對小鼠血清中性激素水平的影響（，n=10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

圖2 杜仲補天素膠囊對小鼠原代腎細胞凋亡的影響

表4 杜仲補天素膠囊對小鼠腎臟組織中氧化指標的影響（，n=10）

表4 杜仲補天素膠囊對小鼠腎臟組織中氧化指標的影響（，n=10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.7 杜仲補天素膠囊對小鼠原代腎細胞ROS 水平的影響 ROS是機體內主要的氧化系統，本實驗同時采用流式細胞術對原代腎細胞中ROS 水平進行了檢測。結果如圖3，與正常組相比（17.9%），DES 模型組細胞內ROS 水平極顯著升高（60.9%；P＜0.01），給藥后，生精膠囊組和杜仲補天素低、高劑量組均極顯著降低其ROS 水平（35.8%、38.9%、26.0%；P＜0.01）。

圖3 杜仲補天素膠囊對小鼠原代腎細胞ROS 水平的影響

圖4 杜仲補天素膠囊對小鼠腎臟中TLR4、MyD88 蛋白表達的影響

2.8 杜仲補天素膠囊對小鼠腎臟中TLR4、MyD88 蛋白的表達結果 體內TLR4-MyD88 信號通路的激活參與到體內ROS 的釋放，本實驗對此通路也進行了檢測。結果如圖4，Western blot 結果顯示，與正常組相比，DES 模型組TLR4和MyD88 蛋白表達水平均升高（P＜0.01），給藥后，生精膠囊組和杜仲補天素膠囊高劑量組小鼠腎臟中TLR4 蛋白表達水平降低（P＜0.01），低劑量組小鼠腎臟中TLR4 蛋白表達水平降低（P＜0.05）；生精膠囊組和杜仲補天素膠囊低、高劑量組MyD88 蛋白表達水平均降低（P＜0.05）。

3 討論

近年來，隨著環境污染的加重以及生活壓力的增加，男性不育癥的發病率明顯上升，嚴重影響男女關系和家庭穩定。DES 作為一種合成雌激素，能夠誘發雄性生殖系統疾病，也常作為研究環境內分泌干擾素對雄性個體生殖毒性的模型藥物。腎是人體內重要臟腑之一，中醫認為，腎藏先天之精，主生殖，為人體生命之本原，故稱腎為“先天之本”［10］；腎藏精，主蟄，又稱為“封藏之本”。根據“腎主生殖”理論，腎精充足、腎氣旺盛，則生殖功能正常；腎精不足、腎氣虧虛，則生殖功能異常。研究發現，具有溫補腎陽、填精補血功效的右歸膠囊可直接作用于睪丸曲細精管，保護生精細胞，促進精子的發生和發育［11］；中藥復方制劑溫陽生精湯具有溫補腎陽的功效，能顯著提高腎陽虛雄性不育大鼠血清中睪酮水平，增加精子數量，達到治療男性不育的目的［12］；金匱腎氣丸能通過調控腎陽虛證大鼠生精細胞Bax 和Bcl-2 的表達，抑制生精細胞凋亡，保護生殖能力［13］。生精膠囊含有鹿茸、人參、菟絲子、淫羊藿等多種中藥制成的現代中藥制劑，具有補腎生精、滋陰壯陽的功效，臨床多用于治療男性不育癥，故選用生精膠囊作為本實驗的陽性藥。而杜仲補天素膠囊也含有杜仲、菟絲子、肉蓯蓉、當歸等多種具有補腎的中藥，其是否對生精障礙起治療作用，則是本次實驗的研究重點。

實驗結果顯示，與正常組相比，己烯雌酚使小鼠丸曲細精管間隙增大，細胞排列疏松，生精細胞層次不明且數量減少；睪丸、胸腺、脾臟、腎臟系數以及精子數量和精子活力顯著下降，肝臟系數顯著上升；E2、T 水平顯著降低，FSH、LH 水平顯著升高。給藥后，與DES 模型組相比，杜仲補天素膠囊低、高劑量組曲細精管結構與正常組接近，管間間隙減小，細胞排列稍緊密，高劑量尤為突出；生精膠囊組和杜仲補天素高劑量組精子數量、精子活力以及胸腺、腎臟和睪丸系數顯著上升，肝臟系數顯著降低；血清中E2 水平顯著上升。表示杜仲補天素膠囊對DES 誘導的生精障礙有緩解作用，且高劑量效果較為顯著。故本實驗通過進一步檢測原代腎細胞凋亡和ROS 水平、腎臟組織中氧化應激水平以及TLR4、MyD88 蛋白表達水平，從而探討杜仲補天素膠囊對小鼠生精障礙的作用機制。

中醫學認為“腎為先天之本”，機體的生殖發育以及與生殖發育相關的各種生命活動都由腎所主，故生殖損傷對腎有著不可忽視的影響。流式細胞術檢測原代腎細胞凋亡率結果顯示，DES 模型組細胞凋亡率極顯著升高，給藥后，生精膠囊組和杜仲補天素膠囊組細胞凋亡率均顯著降低。說明杜仲補天素膠囊對己烯雌酚誘導生精障礙小鼠的腎臟損傷有明顯改善作用，為探究其作用機制，我們進一步對腎臟組織中相關指標進行檢測。

活性氧簇（Reactive oxygen species，ROS）是指生物體在有氧代謝條件下產生的含氧自由基。正常狀態下，體內ROS 和抗氧化物質處于動態平衡狀態。病理狀態時，機體會產生大量ROS，平衡被打破。當ROS 水平超過機體自身抗氧化能力時，機體將產生氧化應激［14］。MDA 是脂質過氧化反應過程的最終產物，可以通過與核酸分子中的氨基或蛋白質等發生反應，形成MDA 介導的聚合分子，會對機體造成損傷，因此，檢測MDA 水平能夠反映脂質過氧化程度，從而反映細胞受損的程度［15］。GSH-Px 是一種過氧化物分解酶，能夠有效清除活性氧，終止自由基的反應［16］，從而保護機體。研究發現，DES 可通過降低機體內氧化應激水平，從而引起生殖功能損傷［17］，另有研究表明，氧化機制是DES 導致生殖障礙的一個重要作用機制［18-19］。流式細胞術檢測原代腎細胞ROS 水平結果顯示，DES 模型組原代腎細胞ROS 水平極顯著上升，給藥后，生精膠囊組和杜仲補天素組ROS 水平極顯著降低。氧化應激指標檢測結果顯示，DES 模型組腎臟組織中MDA 水平極顯著上升，GSH-Px 水平極顯著下降，給藥后，生精膠囊組和杜仲補天素膠囊高劑量組MDA 水平顯著降低，GSH-Px 水平顯著上升。提示杜仲補天素膠囊可能通過提高抗氧化酶活性，抑制脂質過氧化物的產生，緩解腎臟損傷，從而改善小鼠生精功能障礙。研究發現，TLR4/MyD88/信號通路參與氧化應激反應［20］，故本實驗進一步探討杜仲補天素膠囊對小鼠生精障礙的緩解作用是否與TLR4-MyD88 信號通路有關。

Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）是一種分布廣泛的模式識別受體［21］，在免疫應答和炎癥反應過程中發揮重要調控作用。MyD88 是TLR4 通路中下游主要的接頭蛋白，在體內其他炎癥通路中，也起著重要作用［22］。TLR4 通過激活MyD88，從而活化核轉錄因子NF-kB，促進炎癥因子表達，進而引起腎臟損傷。WB 結果顯示，DES模型組腎臟組織中TLR4 和MyD88 蛋白表達水平顯著升高，激活了TLR4 通路，而生精膠囊和杜仲補天素膠囊可顯著降低TLR4 和MyD88 蛋白表達水平。提示杜仲補天素膠囊可能通過抑制TLR4/MyD88 通路，緩解腎臟炎癥反應，從而達到調節小鼠生精功能障礙的作用。

綜上所述，杜仲補天素膠囊對己烯雌酚誘導的雄性小鼠生精障礙具有一定的改善作用，其可能與降低腎臟氧化應激水平及抑制TLR4/MyD88 信號通路有關。環境雌激素導致的男性生殖障礙發病率逐年升高，隨著杜仲補天素膠囊作用機制的進一步研究，杜仲補天素膠囊在生精障礙的治療方面將具有良好的應用前景。