苦瓜皂苷對CCl4 誘導大鼠肝纖維化的保護作用

張晨宇，袁志軍，萬林峰，鄢雨晴，曾 芳

（1.宜春市人民醫院 藥學部，江西 宜春 336000；2.武漢協和醫院 藥學部，湖北 武漢 430022）

肝纖維化是指由化學毒物性損傷、慢性肝炎病毒感染、非酒精性脂肪肝、自身免疫性肝病、先天性代謝缺陷、酗酒等因素引起的以肝內結締組織異常增生為主要特征的病理、生理過程［1］。肝纖維化嚴重危害人類健康，在全世界常見的死亡原因中排名第14 位，發病率及死亡率均呈逐漸增加趨勢［2］。目前臨床上治療肝纖維化的主要藥物包括聯苯雙酯、水飛薊素、熊去氧膽酸、西列丙胺、維甲酸及干擾素γ 等，但這些藥物療效并不理想，加之較大的毒副反應和昂貴的治療費用，極大的阻礙了此類疾病的治療［3］。中藥治療肝纖維化具有療效高、低毒副反應、費用低等優點，逐漸得到人們的重視［4］。

苦瓜入藥歷史十分悠久，為葫蘆科苦瓜屬植物，因具有特殊苦味而得名，在亞洲許多地區和國家均有記載［5］。研究表明，苦瓜具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、提高免疫力、降低膽固醇及抗艾滋病等多種顯著的生理活性，其活性成分主要為皂苷、酚類、生物堿、多糖和多肽等［6-8］。苦瓜及其活性成分對肝損傷的作用多見報道，如苦瓜多糖對CCl4誘導的小鼠肝損傷具有保護作用［9］；苦瓜甾醇對乙酰氨基酚所致小鼠肝損傷具有明顯保護作用，機制涉及清除自由基能力的提高及酶防御系統功能的維持等［10］；苦瓜皂苷可通過降低機體氧化應激水平，減輕肝細胞脂肪變性［11］。但是關于苦瓜皂苷對肝纖維化大鼠肝組織的保護作用及機制研究鮮有報道。因此，本研究擬通過建立CCl4誘導的大鼠肝纖維化模型，在探討苦瓜皂苷對肝纖維化保護作用的基礎上，進一步明確其對肝組織抗氧化能力及TGF-β1/Smad信號通路的影響。

1 材料

1.1 動物 SD 大鼠，48 只，雄性，體質量（200±20）g，購自中國科學院斯萊克實驗動物中心，動物生產許可證號SCXK（京）2011-0012；自由飲水，常規條件飼養，飼養1周后用于正式實驗。

1.2 藥物和試劑 苦瓜皂苷（批號20170125，純度為87.2%）購自西安文竹生物科技有限公司，臨用前用0.5%羧甲基纖維素鈉配制所需濃度的混懸液；聯苯雙脂（批號160123）購自北京協和制藥廠；CCl4（批號C128126）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，臨用前用橄欖油稀釋；AST、ALT、LN 及HA 檢測試劑盒（批號分別為20180216、20171209、20180321、20171126）購自上海研晶生物科技有限公司；CAT、SOD 及MDA 等抗氧化能力檢測試劑盒（批號分別為180105、180417、171021）購自南京建成生物工程研究所；TGF-β1、p-Smad 3 多克隆抗體（批號分別為SC-7982、SC-11769）購自美國Santa Cruz 公司。

1.3 儀器 AB-160 型分析天平（美國Denver 公司）；TDL-40B 型臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；DW-HL388 型超低溫冰箱（中科美菱低溫科技有限公司）；UV1800 型紫外可見分光光度計（上海菁華儀器有限公司）；WD-2 102 A型全自動酶標儀（北京六一儀器廠）；Mini-PROTEAN Tetra型蛋白電泳及轉印系統（美國Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥 將SD 大鼠隨機分為正常對照組、模型組、聯苯雙酯組及苦瓜皂苷低、中、高劑量組，每組8 只；苦瓜皂苷低、中、高劑量組給藥劑量設置依據預實驗結果。除正常對照組外，每組大鼠背部皮下均注射CCl4（1 mL/kg），2 次/周，共12 周，正常對照組背部皮下注射等體積橄欖油；第5 周時，聯苯雙酯組灌胃150 mg/kg 聯苯雙酯，苦瓜皂苷低、中、高劑量組分別灌胃給予150、300、600 mg/kg 苦瓜皂苷，正常對照組和肝纖維化模型組灌胃給予等體積0.5%羧甲基纖維素鈉；1 次/d，持續至第12 周，期間密切觀察大鼠一般狀態。

2.2 血清AST、ALT、LN 及HA 水平檢測 末次給藥后24 h，水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈取血；3 000 r/min 離心20 min，分離血清；按照試劑盒說明書中的操作方法，檢測苦瓜皂苷對肝纖維化大鼠血清AST、ALT、LN 及HA水平的影響。

2.3 肝組織抗氧化能力檢測 腹主動脈取血后，剖取大鼠肝臟；固定部位取500 mg 肝組織，經預冷的生理鹽水漂洗沖去表面血液及濾紙拭干后，加適量生理鹽水制備10%肝組織勻漿液；3 000 r/min 離心20 min，吸取上清液分裝至1.5 mL 離心管中，-80 ℃冰箱中凍存備用。采用比色法分別檢測苦瓜皂苷對肝纖維化大鼠肝組織CAT、SOD 及MDA水平的影響。

2.4 肝組織TGF-β1 及p-Smad 3 表達檢測 稱取固定部位的肝組織100 mg，經預冷的生理鹽水漂洗沖去表面血液及濾紙拭干后，加入RIPA 細胞裂解液，置于冰水浴中進行裂解（20 min），然后離心（10 000 r/min，15 min）；BCA法測蛋白濃度。取等量蛋白（10 μg）行10% SDS-PAGE 電泳，常規方法進行轉膜、封閉后，加入TGF-β1 及p-Smad 3一抗（均為1∶1 000），室溫孵育2 h；經緩沖液TBST 洗膜后，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體（二抗），繼續室溫孵育1 h，增強化學發光法顯影。采用圖像分析軟件分析各條帶光密度值，通過目的條帶光密度與內參（GAPDH）光密度的比值進行半定量。

2.5 HE 染色 采用中性甲醛（4%）固定肝組織，經乙醇脫水及石蠟包埋等步驟后，行連續切片后封閉。常規方法進行HE 染色，鏡下觀察肝組織病理形態。

2.6 統計學分析 應用SPSS 15.0 軟件進行分析。所得數據以（）表示，多組間比較采用方差分析；以P＜0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 苦瓜皂苷對肝纖維化大鼠一般狀態的影響 正常對照組大鼠體質量穩步增加，一般狀態良好，反應敏捷，皮毛光澤；肝纖維化模型組大鼠體形消瘦，一般狀況較差，反應遲鈍，皮毛缺少光澤；苦瓜皂苷組一般狀態好于肝纖維化模型組，反應較敏捷，皮毛基本光澤。

3.2 苦瓜皂苷對肝纖維化大鼠血清AST 及ALT 水平的影響 與正常對照組比較，肝纖維化模型組大鼠血清AST、ALT 水平升高（P＜0.05）；與模型組大鼠比較，低、中、高劑量苦瓜皂苷組大鼠血清AST、ALT 水平均降低（P＜0.05）。見表1。

表1 苦瓜皂苷對肝纖維化大鼠血清AST、ALT 水平的影響（，n=8）

表1 苦瓜皂苷對肝纖維化大鼠血清AST、ALT 水平的影響（，n=8）

注：與正常對照組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

3.3 苦瓜皂苷對肝纖維化大鼠血清LN 及HA 水平的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠血清LN、HA 水平升高（P＜0.05）；與肝纖維化模型組大鼠比較，低、中、高劑量苦瓜皂苷組大鼠血清LN 水平降低（P＜0.05），中、高劑量苦瓜皂苷組HA 水平降低（P＜0.05）。見表2。

表2 苦瓜皂苷對肝纖維化大鼠血清LN 及HA 水平的影響（，n=8）

表2 苦瓜皂苷對肝纖維化大鼠血清LN 及HA 水平的影響（，n=8）

注：與正常對照組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

3.4 苦瓜皂苷對肝纖維化大鼠肝組織抗氧化能力的影響 與正常對照組比較，肝纖維化模型組大鼠肝組織CAT、SOD 水平降低，而MDA 水平升高（P＜0.05）；與肝纖維化模型組大鼠比較，中、高劑量的苦瓜皂苷組大鼠肝組織CAT 水平和低、中、高劑量的苦瓜皂苷組SOD 水平均升高，而苦瓜皂苷各劑量組MDA 水平降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 苦瓜皂苷對肝纖維化大鼠肝組織抗氧化能力的影響（，n=8）

表3 苦瓜皂苷對肝纖維化大鼠肝組織抗氧化能力的影響（，n=8）

注：與正常對照組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

3.5 苦瓜皂苷對肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1 及p-Smad 3表達的影響 與正常對照組比較，肝纖維化模型組大鼠肝組織TGF-β1 及p-Smad 3 表達增加（P＜0.05）；與肝纖維化模型組大鼠比較，低、中、高劑量的苦瓜皂苷組大鼠肝組織TGF-β1 及p-Smad 3 蛋白表達均降低（P＜0.05）。見表4、圖1。

表4 苦瓜皂苷對肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1 及p-Smad 3表達的影響（，n=8）

表4 苦瓜皂苷對肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1 及p-Smad 3表達的影響（，n=8）

注：與正常對照組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

圖1 Western blot 檢測各組TGF-β1、p-Smad 3 蛋白表達

3.6 苦瓜皂苷對肝纖維化大鼠肝組織病理形態的影響 正常對照組大鼠肝細胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列，形態正常，肝小葉完整；肝纖維化模型組大鼠肝細胞排列紊亂、腫脹嚴重且許多肝細胞脂肪變性呈空泡狀，可見大量纖維結締組織增生，肝小葉破壞嚴重；與肝纖維化模型組大鼠比較，苦瓜皂苷組肝細胞排列基本正常，病變程有不同程度的緩解。見圖2。

圖2 HE 染色檢測苦瓜皂苷對肝纖維化大鼠肝組織病理形態的影響（×200）

4 討論

本研究通過灌胃給予肝纖維化模型大鼠低、中、高劑量的苦瓜皂苷后，發現其可以有效降低模型大鼠血清AST及ALT 水平。AST 和ALT 為世衛組織推薦的檢測肝功能損傷與否的最敏感指標，當肝功能受損時，血清AST 和ALT水平顯著增加［12］；而苦瓜皂苷可以有效降低模型大鼠血清AST 和ALT 水平，表明其具有保護肝臟損傷作用。在肝纖維化過程中，細胞外基質的代謝產物如LN 和HA 等釋放入血，因而血清中LN 和HA 水平可反應肝纖維化程度［13］。本研究發現，與肝纖維化模型組大鼠比較，低、中、高劑量的苦瓜皂苷組大鼠血清LN 及HA 水平均有不同程度的降低，其中各劑量組的LN 水平及中、高劑量組的HA 水平呈顯著性降低，以上結果進一步表明苦瓜皂苷具有減輕模型大鼠肝纖維化程度的作用。

肝纖維化病理機制復雜，大量證據表明，多種因素所致肝纖維化均伴有氧化應激水平的增加，氧化應激與肝纖維化發病機制之間的關系受到越來越多的重視［14］。國內外很多學者嘗試應用抗氧化劑治療各種病因所致的肝纖維化，取得較好效果，如白藜蘆醇、維生素E、褪黑激素及水飛薊素等均可以通過抑制脂質過氧化反應，降低氧化應激水平，進而起到減輕肝纖維化程度的作用［15］。由于CAT 及SOD 是細胞內清除氧自由基的主要抗氧化物酶，而MDA 是脂質過氧化過程中的最終產物，因此，通過檢測CAT、SOD 及MDA 水平可以反映細胞受氧化損傷的嚴重程度［16］。本研究結果發現，與肝纖維化模型組大鼠比較，各劑量的苦瓜皂苷組大鼠肝組織CAT 和SOD 水平均顯著升高，而MDA 水平則顯著降低；以上結果提示，苦瓜皂苷對CCl4誘導的肝纖維化大鼠的保護作用可能與抗氧化作用有關。

TGF-β1/Smad 信號通路在肝纖維化的發生及發展中具有重要作用，TGF-β1 具有刺激肝星形細胞增殖與活化的作用，而Smad 蛋白可將TGF-β1 信號由細胞漿轉導至細胞核，從而調控LN、HA 及羥脯氨酸等蛋白的表達，最終導致肝纖維化的發生與進展［17-18］。研究表明，夏枯草總三萜對CCl4誘導的肝纖維化大鼠具有較好的保護作用，其機制可能與調控TGF-β1/Smad 信號通路及下調p-ERK 表達有關［19］。丹參素及白芍總苷等對肝纖維化大鼠的保護作用也均與抑制TGF-β1/Smad 信號通路的活化有關［20-21］。本研究結果同樣發現，灌胃給予肝纖維化模型大鼠低、中、高劑量的苦瓜皂苷后，模型大鼠肝組織TGF-β1 及p-Smad 3 蛋白表達水平顯著降低。此結果提示，苦瓜皂苷對CCl4誘導的肝纖維化大鼠的保護作用可能與抑制TGF-β1/Smad 信號通路的活化有關。

綜上所述，苦瓜皂苷對CCl4誘導的肝纖維化大鼠具有較好的保護作用，該作用與抗氧化及抑制TGF-β1/Smad 信號通路有關。