基于LC-MS 和網絡藥理學探討銀杏酮酯治療合并心血管疾病的新型冠狀病毒肺炎的研究

劉新娟，江美芳，俞 婷，王丹丹，朱國琴，高 崎，*

（1.上海中醫藥大學，上海 201203；2.上海上藥杏靈科技藥業股份有限公司，上海 201703）

銀杏Ginkgo biloba L.為銀杏科銀杏屬植物，常以其葉和種子入藥，藥典記載銀杏葉歸心、肺經，有活血化瘀、斂肺平喘等功效。銀杏葉進行醇提、水提、柱層析、雙層吸附等生產工藝后獲得銀杏葉制劑GBE50，其中銀杏黃酮高達44%以上，GBE50 制劑包括分散片、滴丸等，臨床用于治療心血管疾病［1］。本文通過LC-MS 技術獲得銀杏酮酯5 大類成分，其中銀杏總黃酮有抗炎和抗心肌缺血作用［2］；雙黃酮有抗凝血和抗感染作用［3］；萜內酯有抗心肌梗死、保護心血管作用［4］；有機酸成分具有抗氧化作用［5］；黃烷醇有抗流感病毒作用等［6］。綜合認為GBE50 除了有治療心血管疾病外還具有潛在抗病毒和抗炎藥理活性。

2019 年12 月以來，一種由新型冠狀病毒（2019-nCoV）感染引起的肺炎（COVID-19）對全球人類健康造成極大威脅，2019-nCoV 感染可能會導致心臟損傷，且具有心血管基礎疾病的新冠肺炎患者預后明顯較差，而新冠肺炎中醫診療方案中對于具有心血管疾病合并癥的患者缺少更為精細化的用藥指導。推測GBE50 對心血管疾病合并COVID-19 具有一定的療效，在此基礎上應用網絡藥理學方法探究GBE50 已知活性成分治療心血管疾病合并COVID-19 的作用及其機制，為GBE50 有效成分研究提供理論依據，同時為治療心血管疾病合并COVID-19 提供新的用藥選擇。

1 材料與方法

1.1 儀器及材料 Waters Acquity UPLC/Xevo G2-XS Q-TOF超高效液相色譜質譜聯用儀，Waters UNIFI 軟件，Sartorius SQPQUINTIX65-1CN 分析天平，KQ-700DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），Milli-Q 超純水器（美國Millipore 公司），高速離心機（上海菲恰爾分析儀器有限公司）。銀杏酮酯片（上海上藥杏靈科技藥業股份有限公司），醋酸銨、甲酸、乙腈、甲醇。

1.2 GBE50 活性成分 稱取銀杏酮酯原料藥0.1 g，置具塞離心管中，加入50%甲醇10 mL，渦旋振蕩1 min，超聲提取15 min，再振蕩1 min，離心（6 000 r/min）10 min，分取上清液于25 mL 容量瓶中，重復上述操作1 次，合并2次上清液，用50%甲醇定容至25 mL，搖勻，進樣。在含0.1%甲酸0.2 mol/L 醋酸銨溶液-乙腈質譜條件下梯度洗脫75 min，UPLC-Q-TOF/MS 分析得到銀杏酮酯總離子流圖。根據總離子流圖所得到的化合物精確分子量、二級碎片信息，與對照品和參考文獻相比對，獲得全部成分信息。

1.3 關鍵靶點的富集 在TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）、SymMap（http：//www.symmap.org/）、BATMANTCM（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）、YaTCM（http：//cadd.pharmacy.nankai.edu.cn/yatcm/home）和SwissTargetPrediction（http：//swisstargetprediction.ch/）數據庫中預測活性成分的靶點。在TTD（http：//bidd.nus.edu.sg/group/ttd/ttd.asp）、Drugbank（https：//www.drugbank.ca/）、HGDB（http：//www.hgdb.ir）和DisGeNET（https：//www.d-isgenet.org/）數據庫中查詢心血管疾病、炎癥及病毒性疾病獲得相關靶點。取活性成分作用靶點與疾病相關靶點交集，獲得GBE50 治療心血管疾病合并COVID-19 患者的關鍵靶點。

1.4 網絡構建與分析 疾病-活性成分-關鍵靶點導入Cytoscape 3.6.0 軟件，構建“疾病-活性成分-關鍵靶點”網絡，并應用Cytoscape 軟件中“Network Analyzer”功能進行網絡分析，根據Degree 值篩選出重要成分。

分別將GBE50-心血管疾病、GBE50-抗炎、GBE50-抗病毒靶點及GBE50-3 種疾病合并靶點分別導入STRING（http：//string-db.org/）數據庫，限定物種為人，設定置信度≥0.9，將得到的文本數據分別導入Cytoscape3.6.0 軟件構建PPI 網絡，應用“Network Analyzer”功能進行網絡拓撲指標分析，篩選Degree 值較高的靶點，整理獲得PPI關鍵靶點數據表。保留GBE50-3 種疾病合并靶點網絡圖，并應用MCODE 插件進行靶點分類。

1.5 GO 分析和KEGG 通路分析 將關鍵靶點導入DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）數據庫，選擇研究背景為人，選擇生物過程（Biological Process，BP）、細胞組成（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）及KEGG 通路進行數據下載，通過Omic share（http：//omicshare.com/）進行可視化分析。

1.6 分子對接驗證 從RSCB PDB 數據庫（https：//www.rcsb.org/）下載心血管靶點AKT1、2019-nCoV 3CL 水解酶蛋白及被確定為2019-nCoV 刺突蛋白的受體［7］—ACE2 的晶體復合物。運用PyMOL 軟件對靶蛋白中進行修飾，移除其中的小分子和配體，保存為pdb 格式文件。從PubChem 數據庫獲取關鍵化合物的2D 結構，應用OpenBabel 2.4.1 軟件將其保存為mol 格式，最后運用Swissdock（http：//www.swissdock.ch/docking）平臺對關鍵成分和靶點進行分子對接。

2 結果

2.1 GBE50 有效成分獲取 UPLC-Q-TOF/MS 分析得到GBE50 總離子流圖（圖1），通過與文獻及對照品比對，共鑒定出73 個化學成分，包含萜內酯、黃酮及其苷類、有機酸、黃烷醇、雙黃酮5 大類。基本覆蓋了GBE50 總離子流圖中響應顯著高于基質效應的化學成分，其中有39 種成分與對照品比對過且能在Pubchem、TCMSP 等數據庫中檢索到相關信息，這些成分總相對含量在73 個化學成分中占比約為75.6%，能代表GBE50 中絕大部分化學成分，體現了中藥的多組分、多靶點、整體性的特點，各成分相關信息見表1。其中相對含有量占比表示各成分峰面積與73 個成分總峰面積比值。

圖1 GBE50 的LC-MS/MS 圖譜

2.2 關鍵靶點的富集 通過TCMSP 等中藥數據庫、SwissTargetPrediction 檢索預測活性成分的相關靶點476 個。TTD等數據庫獲得心血管疾病相關靶點4 380 個，炎癥靶點652個，病毒感染類疾病靶點807 個，成分靶點與疾病靶點取交集（圖2）。獲得GBE50 成分靶點中抗心血管疾病、抗炎或抗病毒的靶點共356 個，僅具有抗心血管疾病的靶點有338 個，具有抗炎靶點114 個，抗病毒作用的靶點有103個。其中CVD 表示心血管類疾病靶點、I 表示炎癥靶點、V表示病毒性疾病靶點、compound 表示GBE50 成分靶點。

2.3 成分-疾病-靶點網絡圖的構建 將3 種疾病對應的39個活性成分與365 個靶點導入Cytoscape 3.6.0 軟件中構建GBE50 治療“疾病-成分-靶點”網絡圖（圖3）。圖3 共涉及398 個節點和1 552 條邊，其中成分-靶點網絡有395 個節點，997 條邊。圖中菱形代表黃酮及其苷類，平行四邊形代表雙黃酮類，八邊形代表萜內酯類，六邊形代表有機酸類、三角形代表黃烷醇類；倒三角形代表疾病；圓形代表關鍵靶點。幾種疾病靶點在5 類成分中都有不同程度的分布，以黃酮類的槲皮素、芹菜素；雙黃酮類紅杉雙黃酮、金松雙黃酮；萜內酯類銀杏內酯A；有機酸類咖啡酸；黃烷醇類沒食子兒茶素等靶點較多，為GBE50 發揮作用的關鍵性成分。

表1 GBE50 成分信息數據

圖2 成分靶點與疾病靶點韋恩圖

2.4 PPI 網絡的構建分析 分別將GBE50-炎癥114 個靶點、GBE50-病毒性疾病103 個靶點，GBE50-心血管疾病338 個靶點及，GBE50-3 種疾病的356 個靶點導入STRING數據庫，限定物種為人，設定置信度≥0.9，數據導入Cytoscape 軟件構建PPI 網絡圖及關鍵靶點信息，保留治療3種疾病的PPI 網絡圖（圖4）。應用MCODE 插件進行靶點分析，篩選出K-Core 較大的3 組子網絡圖（圖5～7）。圖3中共涉及313 個節點和1 809 條邊，圖中節點越大顏色越淺代表靶點的度值越高，相反顏色越深節點越小代表度值越低，并以該圖對應靶點按度值由大到小進行排序，且列出對應的部分靶點在其他網絡圖中度值，其中T 列代表3 種疾病，CVD 代表心血管疾病，V 代表病毒性疾病，I 代表炎癥。結合圖5～7GBE50 發揮作用可能與AKT1、VEGFA、IL-6、TNF 等關鍵靶點有關。

2.5 KEGG 通路分析 DAVID 數據庫獲得GO 分析中BP組652 條（P＜0.05），CC 組73 條（P＜0.05）、MF 組164條（P＜0.05）、146 條KEGG 信號通路（P＜0.05），分別以P值從小到大對BP 組和KEGG 信號通路結果進行可視化分析。結果表示GBE50 可能參與藥物反應、氧化還原過程、炎癥反應等多條生物過程，乙型肝炎（Hepatitis B）、HIF-1信號通路（HIF-1 signaling pathway）、PI3K-Akt 信號通路（PI3K-Aktsignaling pathway）、非小細胞肺癌（Non-small cell lung cancer）、小細胞肺癌（Small cell lung cancer）等多條信號通路發揮治療心血管肺炎合并新冠肺炎患者的作用。

圖3 疾病-成分-靶點相互作用網絡圖

圖4 心血管疾病合并COVID-19PPI 網絡圖

表2 成分-疾病靶點對應數據表

圖5 K-Core 值較高的部分PPI 子網絡

圖6

圖7

表3 關鍵靶點及其度值

2.6 分子對接 在5 類成分中選取較關鍵的成分與關鍵靶點AKT1、2019-nCoV 3CL 及ACE2 進行分子對接驗證，通過Swissdock 數據庫獲得的分子對接結果如表4 所示，一般認為分子與靶點分子對接的結合能低于0 時分子與配體能夠有效結合，當結合能≤7.0 kJ/mol 時，分子與靶點結合較緊密，其中金松雙黃酮與AKT1、3CLpro、山柰酚與ACE2 等結合能較低。

圖8 GBE50 有效靶點生物過程圖和通路分析圖

圖9 關鍵成分-靶點分子對接圖

表4 部分活性成分與關鍵靶點分子對接數據表

3 討論

GBE50 有活血通絡、益智開竅的功效，與普通銀杏葉提取物相比，GBE50 的成分更為明確，其萜類內酯含有量在6%以上，黃酮在44%以上，其中黃酮醇苷24%、游離黃酮20%，游離黃酮的生物利用度是黃酮醇苷的7 倍。通過“雙重吸附、雙重去除”銀杏酸，使其含有量不高于1 PPM。以GBE50 為代表的第五代銀杏葉制劑的特點為藥效成分含有量高，生物利用度好，毒性物質含量極低。其療效優于一般的銀杏葉制劑，在治療時可作為銀杏葉制劑的首選。

3.1 GBE50 活性成分與關鍵靶點 成分信息數據表中以槲皮素，山柰酚為苷元的苷相對含有量占比較大，而口服給藥后苷多水解成苷元形式被吸收，因此GBE50 給藥后體內槲皮素，山柰酚等苷元相對增高［8］。網絡藥理學結果顯示槲皮素、芹菜素、山柰酚等黃酮類成分可作用于AKT1 等關鍵靶點發揮抗炎抗病毒作用，通過基于假病毒的藥物篩選系統抑制H5N1 病毒的進入，可在流感病毒感染早期抑制其活性，其中槲皮素、山柰酚等成分已被證明可能是治療COVID-19 的關鍵性成分［9-11］。銀杏雙黃酮是GBE50 中的又一類關鍵成分，數據表明6 種雙黃酮成分均可作用于VEGFA，VEGFA［12］活躍于血管新生、生長和內皮細胞生長，藥物［13］可通過PI3K/Akt 信號通路激活VEGFA 啟動子，誘導VEGFAmRNA 的轉錄表達，促進血管形成，改善心肌梗死，從而保護心臟血管。銀杏雙黃酮還能夠抑制炎性因子，如IL-6 等，發揮抗炎作用，如通過減少由HNE 導致的A549 細胞中黏液蛋白5AC基因表達和抑制HNE 處理A549 細胞后p38 與AKT 通路的磷酸化，而抑制IL-8 mRNA的表達，從而減輕肺部炎癥細胞浸潤，達到抑制氣道炎癥的效果［14］。

白果內酯、銀杏內酯A、B、C、J 等是銀杏的特有成分，且在GBE50 相對含有量占比較高［15］，其中4 種成分均作用于ABCB1 靶點，研究證明ABCB1 不同基因形態能夠影響心血管藥物在體內的吸收，它決定心血管藥物體內的利用程度，銀杏內酯A 能夠增加心肌細胞存活率及其收縮幅度，降低Bax 與Bcl-2 的比值等減少心肌細胞的凋亡，銀杏內酯B 對脂多糖誘導的人肺泡上皮細胞炎癥反應有保護作用［16-17］。因此萜內酯類成分也是GBE50 中發揮抗心血管疾病的關鍵成分，兼有抗肺部炎癥的作用。有機酸中咖啡酸的有效靶點數目較多，具有保護和預防心血管疾病的作用，同時具有抗氧化活性，通過抑制5-脂氧合等發揮抗炎作用［18］，另外細胞實驗結果［19］顯示咖啡酸還能抑制由蜂毒肽和花生四烯酸刺激引發的組胺釋放，從而證明咖啡酸有抗病毒的作用。最后黃烷醇類成分中的沒食子兒茶素［20］也可通過影響HIV 的復制過程，起到抑制HIV 病毒的作用。綜合GBE50 中有效成分與關鍵靶點的分析，驗證了GBE50 可通過不同的成分及靶點同時能發揮抗心血管疾病，抗炎癥及抗病毒的作用。

3.2 GBE50 治療合并心血管疾病的COVID-19 重要信號通路 KEGG 通路分析中乙型肝炎、PI3K/Akt 信號通路等是GBE50 治療合并心血管疾病的COVID-19 關鍵信號通路，如任宇超等［21］發現藥物能夠通過調節PI3K/Akt 信號通路抑制冠心病大鼠心肌細胞凋亡，該結果與清肺口服液治療病毒性肺炎的關鍵通路相同，推測GBE50 也可能是通過這些通路起到潛在保護COVID-19 患者的作用［22］。PI3K-Ak信號通路的AKT1 蛋白、COVID-19 的關鍵蛋白2019-nCoV 3CL 水解酶和ACE2 與GBE50 活性成分分子對接驗證了GBE50 不僅具有治療心血管疾病作用，還具有防治COVID-19 作用。

本文應用網絡藥理學方法綜合成分、靶點、通路的數據分析證明了GBE50 通過多成分多靶點發揮治療心血管疾病和抗新冠肺炎的作用，心血管疾病對感染新冠病毒的患者有較大的安全隱患，而GBE50 不僅是治療心血管疾病的良藥，且有抗COVID-19 的潛在作用，臨床運用GBE50 治療具有心血管基礎疾病的新冠肺炎患者，改善其預后，同時為這一時期患者提供可靠的用藥選擇。