高甘油三酯性急性胰腺炎小鼠腹腔巨噬細胞極化表型分析

楊屹，黃啟林，羅晨，劉立業(yè)，孫紅玉*，湯禮軍*

1西南交通大學醫(yī)學院，成都 610003；2西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院全軍普通外科中心，四川省胰腺損傷與修復重點實驗室，成都 610083

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是一種以胰腺損傷和全身炎癥為特征的常見外科急腹癥[1]。 根據(jù)發(fā)病誘因不同，A P 可分為膽源性胰腺炎、酒精性胰腺炎和高甘油三酯性急性胰腺炎(hypertriglyceridemic acute pancreatitis，HTG-AP)等。隨著經濟發(fā)展和國民飲食結構的改變，我國HTG-AP 的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[2-3]。國內一項多中心研究發(fā)現(xiàn)，高三酰甘油已經超過乙醇，成為胰腺炎發(fā)病的第二大誘因[4]。相較于其他原因引起的AP，HTG-AP患者更易發(fā)生系統(tǒng)性炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)和多器官衰竭[5-6]，具有病情易重癥化的特點。本研究通過對腹腔巨噬細胞極化表型進行分析，探究了HTG-AP重癥化的機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 泊洛沙姆407(Poloxamer 407，P-407)、雨蛙素購自美國Sigma-Aldrich公司；動物用異氟烷購自深圳瑞沃德生命科技有限公司；小鼠胰淀粉酶(amylase，AMY)ELISA檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；小鼠腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、IL-10微球檢測(cytometric bead array，CBA)試劑盒，anti-CD16/32抗體，BB700-conjugated anti-CD11c抗體，PE-conjugated anti-F4/80抗體，Transcription Factor Buffer Set購自美國BD公司；APC-conjugated anti-CD206抗體、LIVE/DEAD? Dead Cell Stain Kit購自美國Thermo Fisher公司。小動物麻醉機購自深圳瑞沃德生命科技有限公司；CANTO-Ⅱ流式細胞儀購自美國BD公司；全自動酶標儀購自美國Thermo Fisher公司。

1.2 動物分組及模型制備 8 周齡雄性SP F 級C57BL/6J小鼠，體重18～20 g，購自成都達碩實驗動物有限公司。采用隨機數(shù)字表法分為對照組、高甘油三酯血癥(hypertriglyceridemia，HTG)組、AP組和HTG-AP組，每組8只，12 h晝夜交替光照，自由進食飲水。參考Pan等[7]的方法構建HTG-AP小鼠模型。HTG組和HTG-AP組小鼠隔天1次予以0.5 g/kg P-407腹腔注射誘導HTG，對照組和AP組注射等量生理鹽水；28 d后AP組和HTG-AP組以雨蛙素50 μg/kg 腹腔注射，1次/h，共9次，構建AP模型，對照組和HTG組以同樣方式注射等量生理鹽水。最后一次注射雨蛙素12 h后，采用PBS灌洗腹腔，收集腹腔巨噬細胞；用促凝采血管收集血液標本制備血清；并留取胰腺組織標本，用于后續(xù)實驗。實驗過程符合單位和國家有關實驗動物管理和使用的規(guī)定。

1.3 小鼠血清三酰甘油(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)水平測定 血清標本送西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院檢驗科，按常規(guī)方法檢測TG、TC 水平。

1.4 小鼠血清AMY水平檢測 采用ELISA檢測小鼠血清AMY水平，具體操作步驟嚴格按說明書進行，以全自動酶標儀測定450 nm波長處的OD值。

1.5 小鼠胰腺病理組織學分析 胰腺組織以4%多聚甲醛固定過夜，依次脫水、石蠟包埋、制備4 μm切片、HE染色、封片，光學顯微鏡觀察。采用參考文獻[7-8]報道的評分方法(表1)，從水腫、壞死和有核細胞浸潤3個維度，由2名病理醫(yī)師對組織損傷程度進行雙盲評分。每張切片隨機取5個視野，取其評分的平均值。

表1 胰腺損傷病理特點與評分Tab.1 Pathological characteristics and score of pancreatic injury

1.6 小鼠血清炎性因子檢測 采用CBA試劑盒，通過流式細胞儀對小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平進行檢測，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。用FlowCytomix Pro軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.7 小鼠腹腔巨噬細胞提取及流式細胞術分析 小鼠麻醉后，用5 ml預冷PBS灌洗腹腔，按摩腹腔20 s后收集灌洗液[9]。經PBS洗滌后，先用anti-CD16/32抗體封閉并以LIVE/DEADTMDead Cell Stain Kit區(qū)分死/活細胞；加入PE-conjugated anti-F4/80和BB700-conjugated anti-CD11c，分別作為巨噬細胞共同表面標志和M1型巨噬細胞特異性標志；再以Transcription Factor Buffer Set破膜后加入APCconjugated anti-CD206，作為M2型巨噬細胞特異性標志。在冰上完成上述步驟后上機檢測，并用Flowjo軟件分析檢測結果。

1.8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 小鼠血清TG、TC及AMY水平比較 P-407腹腔注射造模28 d后，對照組、HTG組、AP組、HTG-AP 組血清TG 水平(m m o l/L)分別為0.5 2±0.0 7、37.25±2.01、0.545±0.05、38.14±2.47(圖1A)， 血清T C 水平(m m o l/L)分別為2.2 3±0.1 7、11.46±0.67、2.86±0.23、11.18±0.61(圖1B)。HTG組、HTG-AP組小鼠血清TG和TC濃度與其余兩組比較明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，即HTG小鼠模型建立成功。對照組、HTG組、AP組、HTG-AP組血清AMY水平(ng/ml)分別為175.93±40.19、226.25±54.55、592.82±60.17、653.83±79.00(圖1C)，經雨蛙素作用的AP組和HTG-AP組AMY水平明顯高于另外兩組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，提示AP造模成功。

2.2 小鼠胰腺組織損傷情況及病理評分比較 胰腺組織HE染色結果如圖2所示，AP組小鼠胰腺水腫明顯，小葉間隙廣泛增寬，小葉間隙和腺泡實質均可見單核細胞浸潤，偶見小葉邊緣腺泡細胞壞死；HTG-AP組胰腺實質中腺泡間隙增寬，胰腺小葉結構破壞，并有大量有核細胞浸潤，小葉邊緣局部壞死灶形成；對照組、HTG組胰腺無明顯水腫，結構基本正常，HTG組胰腺實質可見空泡狀的泡沫細胞形成。HTG-AP組小鼠胰腺組織病理評分為7.49±0.33，明顯高于AP組(5.15±0.19)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1 各組小鼠血清TG、TC和AMY水平比較Fig.1 Comparison of levels of TG, TC and AMY in each group

圖2 各組小鼠胰腺組織損傷情況及病理評分Fig.2 Pancreatic tissue injury and histopathological scoring of mice in each group

2.3 小鼠血清炎性因子水平比較 CBA檢測結果顯示，HTG-AP組小鼠血清促炎細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯高于AP組，抗炎因子IL-10水平明顯低于AP組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3)。

2.4 小鼠腹腔巨噬細胞極化表型比較 流式細胞術檢測結果顯示，小鼠腹腔灌洗液巨噬細胞標志F4/80陽性的細胞中，HTG-AP組M1型標志CD11c陽性比例(35.5%±7.1%)明顯高于AP組(22.0%±2.8%)，M2型標志CD206陽性比例(7.6%±1.9%)明顯低于AP組(16.5%±2.6%)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖4)。

圖3 各組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10水平比較Fig.3 Comparison of levels of TNF-α, IL-1β, IL-6 and IL-10 in each group

圖4 各組小鼠腹腔巨噬細胞極化表型的流式細胞術分析Fig.4 Flow cytometry analysis of the polarization phenotype of mice peritoneal macrophages in each group

3 討 論

HTG-AP是指在滿足AP診斷的基礎上，患者發(fā)病時血清TG水平＞1000 mg/dl(11.3 mmol/L)[10]。研究表明，HTG-AP患者血清TG水平與病情嚴重程度呈正相關，是AP病情重癥化的獨立危險因素[11]。因此構建穩(wěn)定的TG升高動物模型對于HTG-AP發(fā)病機制研究具有重要意義。

P-407是一類高分子非離子型表面活性劑，具有毒性低、對實驗動物刺激性小的特點，可以抑制TG代謝中的關鍵酶——脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase，LPL)和肝脂肪酶，導致TG水解速率減慢，引起血漿TG水平升高[12]。P-407誘導的TG升高具有劑量依賴性，且組內均一性好，有利于實驗結果的穩(wěn)定。而傳統(tǒng)的飲食誘導高脂血癥動物模型，由于動物進食量不一及造模后期實驗動物長期進食高脂食物產生的厭食現(xiàn)象，使得實驗動物TG水平常常不能達到HTG-AP的診斷標準，且不同個體間TG水平差異也較大。在本研究中，小鼠發(fā)生AP時TG水平超過正常值30倍以上(圖1A)，可有效模擬HTGAP患者發(fā)病時的嚴重高脂血癥狀態(tài)。

在本研究中，HTG-AP組胰腺組織比AP組表現(xiàn)出更嚴重的組織水腫、炎性細胞浸潤和腺泡細胞壞死，病理損傷評分更高(圖2)。血清細胞因子檢測也發(fā)現(xiàn)，HTG-AP組促炎細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6等升高更為明顯，而抗炎因子IL-10雖相較于對照和HTG組也有所升高，但明顯低于AP組(圖3)。目前普遍認為，血清TNF-α和IL-6等細胞因子與AP及其誘發(fā)的急性肺損傷嚴重程度密切相關[13-14]。HTG-AP組表現(xiàn)出更嚴重的胰腺組織損傷和全身炎癥水平，這也與臨床研究中報道的HTG-AP患者易發(fā)生重癥化相符。巨噬細胞可能在這一過程中起著重要作用。

巨噬細胞是一類固有免疫細胞，具有高度的可塑性，可根據(jù)所處的微環(huán)境向經典活化巨噬細胞(classically activated macrophage)，即M1型巨噬細胞，或替代性活化巨噬細胞(alternatively activated macrophage)，即M2型巨噬細胞極化[15]。M1型巨噬細胞可釋放大量炎性因子，殺死病原體并激活免疫系統(tǒng)；M2型巨噬細胞則主要發(fā)揮抗炎、促進傷口愈合及組織修復等作用。在AP發(fā)病時，腹腔內會產生胰腺炎相關腹水(pancreatitis associated ascitic fluids，PAAF)，其中含有細胞因子、淀粉酶、游離脂肪酸等多種物質[16]。最新研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞吞噬并在胞內活化的胰蛋白酶可激活NF-κB信號通路，釋放大量炎性因子，引發(fā)胰腺損傷和炎癥反應[17]。 腹腔巨噬細胞可直接與PAAF接觸，迅速激活炎癥級聯(lián)反應，放大炎癥信號。而且，促使腹腔巨噬細胞向M2極化有助于AP病情緩解[18]。因此，腹腔巨噬細胞極化表型對于AP病情發(fā)展具有重要意義。

高脂環(huán)境下巨噬細胞受到炎癥刺激時免疫應答強度增強[19]。研究表明，巨噬細胞用三酰甘油分解后的產物軟脂酸干預后，在遭遇炎癥刺激時會誘發(fā)更強烈的炎癥反應，M1極化相關蛋白表達量顯著增加[20]。高脂環(huán)境下單核巨噬細胞吞噬脂質后可激活炎癥相關信號通路，導致促炎細胞因子分泌增加[21]。氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)能與巨噬細胞表面的損傷相關分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)識別受體結合，刺激巨噬細胞產生炎性因子，如誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、TNF-α和單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein 1，MCP1)等，使機體持續(xù)處于炎癥狀態(tài)[22]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，未誘發(fā)AP的HTG組小鼠血清中，促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6濃度均高于對照組(圖3)， 表明HTG可改變實驗動物炎癥水平。此外，HTG組小鼠胰腺中出現(xiàn)大量巨噬細胞吞噬脂質后形成的泡沫細胞(圖2)。HTG環(huán)境下血液循環(huán)中的單核巨噬細胞更多向血管外游出，向組織中浸 潤[23]。胰腺腺泡細胞損傷后泄露到胞外的高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1，HMGB1)、熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)和雙鏈DNA等DAMPs可有效激活巨噬細胞，促使巨噬細胞分泌多種細胞因子和趨化因子[24]。因此，高脂環(huán)境下胰腺中增多的巨噬細胞可能更高效地將包括腹腔巨噬細胞在內的其他部位免疫細胞招募到發(fā)炎的胰腺組織，加重局部組織損傷，放大炎癥信號。

腹腔巨噬細胞是AP時胰腺組織中被招募的巨噬細胞的重要來源之一。研究表明，AP發(fā)生后腹腔巨噬細胞能透過胰腺包膜并浸潤胰腺組織[25]。本研究通過流式細胞檢測發(fā)現(xiàn)，相較于AP組而言，HTG-AP組腹腔巨噬細胞M1極化增多，M2極化減少(圖4)。因此，浸潤到胰腺組織的M1型巨噬細胞比例增加可能是HTG-AP組胰腺組織損傷更嚴重的原因之一。近來有研究報道HTG導致AP發(fā)病以后胰腺組織損傷修復速度放緩[26]。這可能與M2型巨噬細胞比例減少有關。

綜上所述，本研究結果表明，HTG-AP小鼠具有胰腺組織損傷加重和全身炎癥水平升高的特點，這可能與高脂環(huán)境下腹腔巨噬細胞極化狀態(tài)的改變有關。