響應面法優化海藻酸鈉固定幾丁質脫乙酰酶的研究

杭加豪，任思雨，張春光，武波飛，蘇永成，劉姝，焦豫良，盧靜，房耀維，*

（1.江蘇海洋大學海洋生命與水產學院，江蘇連云港222005；2.江蘇海洋大學食品科學與工程，江蘇連云港222005）

幾丁質（chitin）是由N-乙酰氨基葡萄糖通過β-（1，4）鍵連接的線性多糖[1]，也是地球上含量僅次于纖維素的天然多糖生物大分子[2]，但因其不溶于水和一般有機溶劑，難以開發利用其商業價值[3]。殼聚糖（chitosan）是幾丁質脫乙酰度大于55%的產物[4]，也是目前已知唯一的堿性多糖[5]。殼聚糖分子鏈上存在的游離氨基使其溶解性能優于幾丁質[6]。此外，殼聚糖還具有良好的降解性和生物相容性，對人體無害，并且具有抑菌、降血壓、降膽固醇和抗癌等作用，廣泛應用于食品、醫藥、農業、化工、化妝品和環境治理等領域[7-10]。

目前，殼聚糖的制備方法有化學熱堿法和生物酶法[11]。熱堿法是工業上最常用的方法，即向40%的氫氧化鈉或氫氧化鉀中加入幾丁質后70℃加熱制備殼聚糖[12]。該方法雖操作簡單，但存在反應時間長、產品脫乙酰度不穩定和排放物污染環境等缺點[13]。生物酶法利用幾丁質脫乙酰酶（chitin deacetylase，CDA）催化幾丁質脫乙酰制備殼聚糖[14]，其反應條件溫和，產品的脫乙酰度穩定、可控，最為關鍵的是生產過程綠色環保[15]。CDA在碳水化合物活性酶數據庫（www.cazy.org）中屬于碳水化合物脂酶家族4（carbohydrate esterase family 4，CE4）[16]。來自海洋節桿菌 Arthrobacter sp.AW19M34-1的CDA（ArCE4）是目前已知唯一可以催化不溶性幾丁質脫去乙酰基的細菌CDA，易于在大腸桿菌中可溶性表達[17]。但是，重組ArCE4穩定性和活性容易受溫度、pH值和其它外界因素的影響，增加了殼聚糖生產成本。

固定化酶技術為提高CDA穩定性提供了有效的解決途徑。固定化酶技術將游離酶制作成具有催化活性但不溶于水的固相酶，提高了生物酶的穩定性[18]。游離酶經過固定后還易于從產物中分離，可以循環使用，降低了生產成本[19]。海藻酸鈉包埋法是最常用和最有效的酶固定方法之一[20]，該法不會對酶的構象產生影響，并且酶活回收率高，但包埋條件對酶活影響較大[21]。基于此，本研究設計單因素試驗與響應面試驗對海藻酸鈉包埋固定ArCE4的工藝進行優化，并研究固定化酶的酶學性質和操作穩定性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

重組Arthrobacter sp.CDA：江蘇海洋大學海洋生物酶工程實驗室制備保存；海藻酸鈉、氯化鈣（calcium chloride，CaCl2）：國藥集團化學試劑有限公司；戊二醛（glutaric dialdehyde，GA）：阿拉丁試劑有限公司；對硝基-N-乙酰苯胺：上海博微生物科技有限公司。所用試劑皆為分析純。

1.2 儀器與設備

電熱恒溫水浴鍋（HW·SY）：海源儀器廠；高速冷凍離心機（日立CR 22G）：日本HITACHI公司；新世紀紫外可見分光光度計（T6）：北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 固定化酶的制備

參考王靜等[22]以海藻酸鈉為載體、戊二醛為交聯劑對L-阿拉伯糖異構酶固定的方法，對CDA進行固定。將海藻酸鈉溶液與酶液按2∶1（體積比）混合，攪拌均勻。用5 mL注射器將上述混合溶液以緩慢速度滴入CaCl2溶液中，形成尺寸相似的固定化酶凝膠顆粒。4℃靜置硬化一段時間，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）與超純水洗滌凝膠顆粒。干燥后加入一定濃度的GA溶液，25℃振蕩交聯數十分鐘后，用PBS與超純水洗滌凝膠顆粒，4℃保存在PBS中用于后續試驗。

1.3.2 單因素試驗優化固定條件

以30.0 g/L的海藻酸鈉，30.0 g/L的CaCl2，靜置硬化4 h，0.05%的GA溶液，振蕩交聯30 min為基本條件，分別對海藻酸鈉濃度、CaCl2濃度、靜置硬化時間、GA濃度和振蕩交聯時間進行單因素優化。

1.3.3 響應面法優化固定條件

基于單因素試驗結果，選取對固定化CDA酶活影響較大的海藻酸鈉濃度、CaCl2濃度和靜置硬化時間為考察因素，以CDA的酶活為考察指標，根據Box-Behnken原理設計三因素三水平響應面試驗，試驗設計見表1。使用Design-Expert.V8.0.6.1軟件對結果進行響應面回歸分析。

表1 響應面法分析因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3.4 最優條件驗證試驗

分析響應面法試驗數據得到最優的CDA固定條件，用該條件進行5次重復驗證，測定固定化CDA的相對酶活，取其平均值與預測值比較。

1.3.5 固定化CDA酶學性質的測定

1.3.5.1 熱穩定性

將固定化酶和游離酶分別置于 20、30、40、50、60℃水浴鍋中保溫2 h后，于30℃進行酶促反應，測定酶活性以研究固定化酶的熱穩定性。

1.3.5.2 pH值穩定性

將固定化酶和游離酶分別置于pH 3～9的緩沖液中保存20 h后，于30℃進行酶促反應，測定酶活性以研究固定化酶的pH值穩定性。

1.3.5.3 操作穩定性

將固定化酶在相同條件下連續操作10次，測定相對酶活。

1.3.6 CDA酶活性的測定

參考來蔣麗等[23]測定CDA酶活性的方法并稍作修改。試管中加入3 mL 0.05 mol/L pH 7.0的PBS和1 mL 200 mg/L的對硝基-N-乙酰苯胺溶液，30℃預處理15min后加入1mL酶液，酶促反應30min，沸水浴終止酶促反應，5000r/min離心15min，取上清液在400nm處測定上清液吸光值。空白對照組添加1 mL滅活酶液，其余不變。

固定化酶活性的測定是以0.5 g固定化酶代替1 mL游離酶，酶促反應30 min后取出固定化酶顆粒終止反應。以添加0.5 g用滅活酶液制作的固定化酶顆粒為空白對照。

1.3.7 數據處理與分析

每組試驗設置3組平行試驗，用平均值±標準方差的形式表示試驗結果，并用SPSS Statistics 25.0軟件對結果進行統計學分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 海藻酸鈉濃度對固定化酶活性的影響

海藻酸鈉濃度對固定化酶活性的影響見圖1。

圖1 海藻酸鈉濃度對固定化酶活性的影響Fig.1 Effect of sodium alginate concentration on the immobilized enzyme

如圖1所示，固定化酶活性隨著海藻酸鈉濃度的增加而升高，當濃度達到30.0 g/L時酶活性最高；隨著海藻酸鈉濃度繼續升高，酶活性顯著降低。這可能因為當海藻酸鈉濃度過低時，與CaCl2反應形成的凝膠顆粒孔徑大，CDA包埋不緊密，易流失，所以酶活性低；當濃度過高時，溶液黏度大，與CDA溶液混合時酶液分散不均勻，并且制成的凝膠顆粒形狀不規則，有拖尾，影響CDA與底物結合，所以酶活性降低。

2.1.2 CaCl2濃度對固定化酶活性的影響

CaCl2濃度對固定化酶活性的影響見圖2。

圖2 CaCl2濃度對固定化酶活性的影響Fig.2 Effect of CaCl2concentration on the immobilized enzyme

如圖2所示，當CaCl2濃度為30.0 g/L時，固定化酶活性最高。推測原因為Ca2+濃度過低時，凝膠交聯度低，顆粒不易形成，酶包埋不緊密，流失過多，所以酶活性低；Ca2+濃度過高時，凝膠過度交聯，顆粒表面布滿Ca2+，網狀結構孔徑小，阻礙酶與底物結合，所以酶活性低。

2.1.3 硬化時間對固定化酶活性的影響

硬化時間對固定化酶活性的影響見圖3。

圖3 硬化時間對固定化酶活性的影響Fig.3 Effect of solidifying time on the immobilized enzyme

如圖3所示，硬化2 h時，固定化酶活性最高；繼續硬化，酶活性降低。說明硬化時間過長會導致交聯過度，凝膠顆粒表面網狀結構孔徑小，CDA包埋過于緊密，底物難以與其結合。

2.1.4 GA濃度對固定化酶活性的影響

GA濃度對固定化酶活性的影響見圖4。

圖4 GA濃度對固定化酶活性的影響Fig.4 Effect of glutaric dialdehyde concentration on the immobilized enzyme

如圖4所示，當GA濃度為0.025%時，固定化酶活性最高；當GA濃度增加時，酶活性顯著降低。這可能因為適當濃度的GA可以強化海藻酸鈉分子與CDA的交聯，增加固定化CDA的穩定性，而高濃度的GA溶液會使蛋白質變性，從而導致喪失酶活性。

2.1.5 交聯時間對固定化酶活性的影響

交聯時間對固定化酶活性的影響見圖5。

圖5 交聯時間對固定化酶活性的影響Fig.5 Effect of cross-linking time on the immobilized enzyme

如圖5所示，固定化酶活性隨著交聯時間的增加而提高，當交聯時間為30 min時，酶活性最高；繼續延長交聯時間，酶活性降低。這是因為在GA的作用下，CDA與海藻酸鈉凝膠活性位點進行結合，當結合位點達到飽和時，GA開始影響CDA的酶活，導致酶活性降低。

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面數據分析

試驗設計與結果見表2。

對結果進行響應面分析，得到固定化酶活性（U）對海藻酸鈉濃度（A）、CaCl2濃度（B）和靜置硬化時間（C）的三元二次回歸方程為：

表2 響應面法試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface experiment

回歸方程的方差分析見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance in regression model

對測得的固定化酶活性進行方差分析，模型的P值=0.000 8＜0.01，差異極顯著，失擬項的P值=0.391 6＞0.05，差異不顯著。表明該模型與試驗數據擬合合理，回歸方程有較高可信度，誤差小，能夠用來對固定化酶的酶活性進行預測。模型中一次項A和C、二次項A2與交互項AB、AC和BC對固定化酶活性影響顯著，二次項B2和C2對固定化酶活性影響極顯著。說明各固定條件對固定化酶活性影響并非線性關系。

2.2.2 響應面優化結果與分析

響應面3D圖可以直接反映各固定條件間的交互作用對固定化CDA酶活的影響。等高線圖可以體現出各因素交互作用的強弱，橢圓形的等高線表示相互作用顯著；越接近正圓，交互作用越不顯著。各因素對固定化酶活性的影響見圖6。

圖6 各因素對固定化酶活性的影響Fig.6 Interaction effect on activity of immobilized enzyme

如圖6所示，海藻酸鈉濃度和CaCl2濃度之間以及海藻酸鈉和硬化時間之間交互作用較強，而CaCl2濃度和硬化時間之間交互作用較弱。結合各因素交互作用對CDA相對酶活性影響的響應面圖和回歸模型，優化海藻酸鈉包埋法固定CDA的條件，結果為海藻酸鈉濃度27.8 g/L、CaCl2濃度31.0 g/L、靜置硬化1.84 h。各因素取最優值后預測固定化酶活性可達2.13 U/mL。

2.3 最優固定條件驗證結果

5 次重復試驗的結果為 1.98、2.07、2.27、2.01、2.19 U/mL，平均值為2.10 U/mL，與預測值2.13 U/mL相比偏差極小，表明模型可信度高。

2.4 固定化酶的酶學性質

2.4.1 熱穩定性

固定化酶與游離酶的熱穩定性見圖7。

圖7 固定化酶與游離酶的熱穩定性Fig.7 Thermal stability of immobilized enzyme and free enzyme

由圖7可知，CDA適合儲存在低溫環境中，隨著儲存溫度的升高，損失的酶活性越多。當儲存溫度為45℃時，游離酶幾乎沒有酶活性，固定化酶還保留最高酶活20.05%的酶活性。該結果表明CDA的固定化可以提高其溫度穩定性。

2.4.2 pH值穩定性

固定化酶與游離酶的pH值穩定性見圖8。

圖8 固定化酶與游離酶的pH值穩定性Fig.8 pH stability of immobilized enzyme and free enzyme

由圖8可知，CDA儲存在pH 7的緩沖液中效果最佳。pH 3條件下放置20 h后，游離酶幾乎沒有酶活性，固定化酶還保留最高酶活36.70%的活性；pH 9時，游離酶還保留最高酶活32.60%的活性，而固定化酶還保留最高酶活52.70%的活性。該結果表明經過固定后的CDA，pH值穩定性有所提高。

2.4.3 操作穩定性

固定化CDA的操作穩定性見圖9。

圖9 固定化CDA的操作穩定性Fig.9 The operation stability of immobilized CDA

如圖9所示，固定化酶活性隨循環操作次數的增加而降低。這是因為連續操作使凝膠強度降低，酶漏失過多，導致酶活性降低。固定化酶在連續操作6次后，酶活性依然保持最高酶活性的60.39%。

3 結論

本試驗使用海藻酸鈉包埋法對CDA進行固定，通過設計單因素試驗和響應面試驗對固定條件進行優化，得到最優條件：海藻酸鈉濃度為27.8 g/L，CaCl2濃度為31.0 g/L，硬化1.84 h，GA濃度為0.025%，交聯30 min。重復試驗驗證了優化結果，與預測值偏差較小。通過對比固定化酶和游離酶的酶學性質，發現固定化酶的熱穩定性和pH值穩定性相較于游離酶有明顯提升。固定化酶的操作穩定性研究表明，在連續操作6次后，固定化酶活性依然保持最高酶活的60.39%。CDA是催化幾丁質脫乙酰制備殼聚糖的酶，提高幾丁質脫乙酰的穩定性可以降低成本，提高殼聚糖制備效率。本研究為固定化CDA催化制備殼聚糖的工業應用奠定了試驗基礎。