超聲輔助纖維素酶法制備杏鮑菇蛋白質工藝優化

許新月，崔文玉，黃澤天，弓志青，王文亮，王延圣，*

（1.山東省農業科學院農產品研究所，山東濟南250100；2.聊城市陽谷縣農業農村局，山東聊城252300）

杏鮑菇屬于傘菌目、側耳科、側耳屬[1]，因其營養豐富口感鮮美，具有草原牛肝菌之稱[2]。杏鮑菇營養物質豐富，蛋白質、膳食纖維含量較多，脂肪、灰分含量少，是優質的蛋白來源。杏鮑菇蛋白的抗炎性、抗病毒性以及抗氧化性等功能已經得到研究人員證實[3-4]。杏鮑菇蛋白中具有人體必需氨基酸，在進入人體消化系統后生成分子量不同的肽，其中小分子肽對降血壓、提高人體免疫力，以及預防癌癥等均有良好的功效，已逐漸成為研究熱點[5-6]。現已有研究人員對杏鮑菇蛋白的提取方式進行了研究，本文在已有研究的基礎上將超聲與纖維素酶解的方式結合在一起，通過響應面分析進一步優化杏鮑菇蛋白提取方式，顯著提高了提取率，為下一步杏鮑菇蛋白功能活性研究奠定了基礎[7-10]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料與試劑

杏鮑菇：濟南華聯超市；考馬斯亮藍G-250染料試劑、牛血清蛋白標準品：美國Sigma公司；纖維素酶（400 U/mg）：上海源葉有限公司；氫氧化鈉（片狀）：國藥集團化學試劑有限公司；鹽酸（分析純）：萊陽經濟技術開發區精細化工廠。

1.1.2 儀器與設備

SHZ-A水浴恒溫振蕩器：上海博訊醫療生物儀器股份有限公司；SB25-12DTb超聲水浴鍋、SCIENTZ-10N冷凍干燥機：寧波新芝生物科技股份有限公司；AR423CN電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；CR22GⅢ高速冷凍離心機：日本日立（HITACHI）公司；SG2便攜式pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV-6100型紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；GZX-9240MBE電熱鼓風干燥箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；78HW-1型恒溫磁力攪拌器：江蘇省金壇市榮華儀器制造公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 杏鮑菇粉末的制備

將杏鮑菇清洗后切片，放入50℃電熱鼓風干燥箱中烘干，使用高速粉碎機打粉后過100目篩，置于干燥器中保存。

1.2.2 杏鮑菇蛋白的提取

取定量杏鮑菇干粉，按照試驗設計選取料液比、時間、溫度、pH值，杏鮑菇粉末水提一定時間后8000r/min離心10min，取上清液，用考馬斯亮藍法測定蛋白含量。

1.2.3 牛血清蛋白標準曲線繪制

稱取29.25 g NaCl固體溶于500 mL去離子水中，配置成0.15 mol/L NaCl溶液，0.1 g牛血清蛋白溶于1 000 mL去離子水中配置成100 μg/mL的標準蛋白溶液[11]。取 7 個干凈的試管編號 0、1、2、3、4、5、6，向每只試管中分別加入 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 的標準蛋白溶液后，每只試管中分別加入 1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4 mL的NaCl溶液，再分別加入5 mL的考馬斯亮藍G-250溶液[12-13]，混勻后靜置5 min，以0號試管作為空白對照，于595 nm處測定吸光值。得出線性方程為y=0.008 8x+0.008 3，相關系數R2=0.998 8。

1.2.4 指標的測定

杏鮑菇總蛋白含量采用凱氏定氮法測定；上清液中蛋白含量采用考馬斯亮藍法測定；杏鮑菇蛋白提取率的計算：蛋白提取率/%=（上清液中蛋白含量/杏鮑菇總蛋白含量）×100[12]。

1.2.5 單因素試驗設計

1.2.5.1 料液比對蛋白提取率的影響

杏鮑菇粉1 g，超聲功率300 W，超聲20 min，研究1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35、1 ∶40（g/mL）料液比對杏鮑菇蛋白提取率的影響[14-17]。

1.2.5.2 超聲功率對蛋白提取率影響

杏鮑菇粉 1 g，料液比 1∶30（g/mL），超聲功率分別為 100、200、300、400、500 W，超聲 20 min。

1.2.5.3 超聲時間對蛋白提取率得影響

杏鮑菇粉 1 g，料液比 1 ∶30（g/mL），超聲功率400 W，分別超聲 10、15、20、25、30 min。

1.2.5.4 纖維素酶酶解時間對蛋白提取率的影響

向超聲后的樣品中添加杏鮑菇粉質量2%的纖維素酶，pH 7.0，酶解溫度 20 ℃，分別酶解 25、30、35、40、45 min。

1.2.5.5 纖維素酶酶解pH值對蛋白提取率的影響

向超聲后的樣品中添加杏鮑菇粉質量2%的纖維素酶，酶解溫度20℃，酶解時間30 min，酶解pH 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0。

1.2.5.6 纖維素酶酶解溫度對蛋白提取率的影響

向超聲后的樣品中添加杏鮑菇粉質量2%的纖維素酶，酶解pH 7.0，酶解時間30 min，酶解溫度25、30、35、40、45、50 ℃。

1.2.5.7 纖維素酶添加量對蛋白提取率的影響

纖維素酶酶解pH 7.0，酶解時間30 min，酶解溫度20℃，纖維素酶添加量為杏鮑菇粉質量的1%、2%、3%、4%、5%[18-20]。

1.2.6 響應面試驗設計

在單因素試驗基礎上，選取具有顯著影響的功率（A）、時間（B）、料液比（C）、纖維素酶添加量（D）為自變量，杏鮑菇蛋白提取率為響應值（Y），使用Design-Expert 8.0.5b軟件Box-Behnken中心組和試驗設計原理，進行四因素三水平響應面分析，建立杏鮑菇蛋白提取率的二次多項式數學模型[21-22]。試驗因素及編碼水平見表1。

表1 試驗因素與水平表Table 1 Experimental factors and level table

1.3 數據分析

使用Excel和Design-Expert 8.0.5b進行數據分析和繪圖。

2 結果與分析

2.1 杏鮑菇蛋白提取率影響因素的研究

2.1.1 料液比對杏鮑菇蛋白提取率的影響

不同料液比對杏鮑菇蛋白提取率的影響見圖1。

圖1 料液比對杏鮑菇蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of ratio of material to liquid on protein extraction rate of Pleurotus eryngii

分析圖1得出，隨著液體體積增大，蛋白提取率增加，在料液比1∶30（g/mL）時提取率最大，此后隨液體體積的增大蛋白提取率呈下降趨勢。在液體體積較低時杏鮑菇粉擴散作用較弱，蛋白提取率低；當液體體積較高時，蛋白與溶液之間的濃度差較小不利于蛋白溶出。因此選擇料液比1∶30（g/mL）進行下一步試驗。

2.1.2 超聲功率對蛋白提取率的影響

不同超聲功率對蛋白提取率的影響試驗結果見圖2。

分析圖2得出，杏鮑菇蛋白提取率在100 W～400 W范圍內，隨超聲功率的提高逐漸增大，在超聲功率400W時達到最大，此后超聲功率提高，蛋白提取率下降。在隨著超聲功率增大的過程中，超聲破碎杏鮑菇的細胞壁使其細胞中的蛋白溶出，蛋白提取率增加；超聲功率繼續增大，超聲破壞已溶出的蛋白質，蛋白提取率降低。

2.1.3 超聲時間對蛋白提取率的影響

不同超聲時間對蛋白提取率的影響試驗結果如圖3所示。

圖2 超聲功率對杏鮑菇蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on protein extraction rate of Pleurotus eryngii

圖3 超聲時間對杏鮑菇蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on protein extraction rate of Pleurotus eryngii

在10 min～20 min范圍內，隨著超聲時間的延長，蛋白提取率增大，在20 min時達到最大，隨著時間繼續增加，蛋白提取率降低。超聲前期杏鮑菇細胞破碎蛋白溶出，提取率升高；后期超聲過程中，破碎已溶出的蛋白，同時超聲時間過長產生熱量對蛋白具有破壞作用，故提取率降低。

2.1.4 纖維素酶酶解時間對蛋白提取率的影響

不同纖維素酶酶解時間對杏鮑菇蛋白提取率的影響試驗結果如圖4所示。

圖4 纖維素酶酶解時間對杏鮑菇蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of cellulase hydrolysis time on protein extraction rate of Pleurotus eryngii

在25 min～35 min范圍內，隨著酶解時間的增加，蛋白提取率增大，在35 min時達到最大，隨后呈現下降的趨勢。隨著時間繼續增加，纖維素酶進一步對破碎后的杏鮑菇細胞壁進行水解，蛋白質溶出，提取率升高；時間增加，凝集沉淀，提取率降低。

2.1.5 纖維素酶酶解pH值對蛋白提取率的影響

不同纖維素酶酶解pH值對杏鮑菇蛋白提取率的影響試驗結果如圖5所示。

圖5 纖維素酶酶解pH值對蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of cellulase hydrolysis pH value on protein extraction rate

pH 4.0時，杏鮑菇蛋白提取率最低，因為該pH值位于杏鮑菇等電點附近，蛋白凝集沉淀，提取率最低。pH 6.0時蛋白提取率最高，此時纖維素酶活性最大，蛋白質-水相互作用增強，溶解性提高；此后，隨pH值增大，纖維素酶活性降低，提取率降低。

2.1.6 纖維素酶酶解溫度對蛋白提取率的影響

不同纖維素酶酶解溫度對蛋白提取率影響試驗結果如圖6所示。

圖6 纖維素酶酶解溫度對杏鮑菇蛋白提取率的影響Fig.6 Effect of cellulase hydrolysis temperature on protein extraction rate of Pleurotus eryngii

分析圖6可以看出，杏鮑菇蛋白提取率呈現先升高后下降趨勢，溫度30℃時，提取率最高，纖維素酶活性最大；溫度繼續升高，纖維素酶活性下降，杏鮑菇蛋白受熱分解，提取率下降。

2.1.7 纖維素酶添加量對蛋白提取率的影響

不同的纖維素酶添加量對杏鮑菇蛋白提取率的影響試驗結果如圖7所示。

圖7 纖維素酶添加量對杏鮑菇蛋白提取率的影響Fig.7 Effect of cellulase addition on protein extraction rate of Pleurotus eryngii

隨著纖維素酶添加量的增加，蛋白提取率呈現先升高后下降的趨勢，在添加量為2%時蛋白提取率最高，在一定的料液比情況下隨纖維素酶增加蛋白提取率升高，纖維素酶添加量增大，總固形物含量上升，杏鮑菇粉擴散作用減弱，同時纖維素酶擴散作用降低，蛋白提取率降低。

2.2 響應面試驗設計分析與提取工藝優化

2.2.1 二次回歸方程模型的建立

固定纖維素酶酶解時間35 min，纖維素酶酶解pH 6.0，纖維素酶酶解溫度30℃，以有顯著影響的功率、時間、料液比、纖維素酶添加量為自變量，杏鮑菇蛋白提取率為響應值，試驗設計與試驗結果見表2[8，21-23]。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Response surface experiment design and results

續表2 響應面試驗設計及結果Continue table 2 Response surface experiment design and results

采用Design-Expert 8.0.5b數據分析軟件進行試驗結果的回歸分析，得到關于蛋白提取率（Y）以及A、B、C、D 的回歸模型：Y=37.04-0.067A-1.34B+2.77C-0.81D-0.15AB+2.12AC+0.92AD+3.27BC+0.45BD+1.60CD-3.22A2-2.03B2-5.44C2-3.75D2。

回歸模型方差分析如表3所示。

該模型F=21.56，P<0.001，顯示為杏鮑菇蛋白提取效果回歸模型極顯著；回歸方程失擬項的F值為0.17表明失擬項與誤差項相比效果不明顯；決定系數R2=0.955 7，顯示出此模型的擬合程度較好，能夠使用該模型對杏鮑菇蛋白提取進行預測分析。

2.2.2 交互作用分析

在該模型A、B、C、D 4個因素中C因素效果極顯著，B、D因素效果顯著，A不顯著；交互作用中，AB、AD、BD交互作用不顯著，AC、CD交互作用顯著，BC交互作用極顯著；在二次項中A2、C2、D2效果極顯著，B2效果顯著；由F檢驗可以看出A、B、C、D四個因素對蛋白提取率的影響為C>B>D>A，即料液比>超聲時間>纖維素酶添加量>超聲功率。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Regression model analysis of variance

2.2.3 響應面分析與優化

各因素交互作用對杏鮑菇蛋白提取率的響應面圖見圖8。

在圖 8（a）～（c）中，響應面圖的形狀起伏越大，兩個因素之間差異越明顯。等高線圖中，等高線形狀趨近于橢圓形則交互作用明顯，若等高線形狀趨近于圓形則交互作用不明顯。

圖8（a）中，當超聲時間以及纖維素酶添加量一定時，隨超聲功率以及料液比的變化，蛋白質提取率整體呈現先升高后下降的趨勢，料液比變化幅度大于超聲功率，提取率最高為35.7%。等高線圖呈現橢圓形，交互作用顯著。

圖8 各因素交互作用對杏鮑菇蛋白提取率的響應面圖Fig.8 Response surface diagram of the interaction of various factors on the protein extraction rate of Pleurotus eryngii

圖8（b）中，當超聲功率與纖維素酶添加量一定時，隨著超聲時間與料液比的變化，蛋白提取率整體變化明顯，響應面圖中隨著超聲時間的變化蛋白提取率變化明顯，先升高后下降的趨勢明顯，料液比變化幅度大于超聲時間，提取率最高為36.7%。等高線圖中呈現橢圓形，超聲時間與料液比的交互作用極顯著。

圖8（c）中，當超聲時間與超聲功率一定時，隨著料液比和纖維素酶添加量的變化，響應面圖蛋白提取率整體變化明顯，料液比變化幅度大于纖維素酶添加量，提取率最高為35.4%。等高線圖呈現橢圓形，交互作用顯著。

2.2.4 回歸模型驗證

Design-Expert 8.0.5b分析結果表明，最佳料液比為1∶30.31（g/mL）、超聲功率398.7 W、超聲時間 20.4 min、纖維素酶添加量1.92%。杏鮑菇蛋白提取率理論值為75.1%。根據實際修正為料液比1∶30（g/mL）、超聲功率400 W、超聲時間20 min、纖維素酶添加量2%，得到的杏鮑菇蛋白提取率為75.7%，相對偏差0.79%，可見該模型能夠較好預測蛋白提取條件。

3 結論

對杏鮑菇蛋白提取的研究，從料液比、超聲功率、超聲時間、纖維素酶酶解時間、纖維素酶酶解pH值、纖維素酶酶解溫度、纖維素酶添加量7個方面對杏鮑菇蛋白提取影響因素進行了研究，選取了4個具有顯著影響效果的因素進行響應面分析，由F檢驗得出對杏鮑菇蛋白提取效果影響順序為料液比>超聲時間>纖維素酶添加量>超聲功率。優化后得到最佳提取條件為料液比 1∶30（g/mL）、超聲功率 400 W、超聲時間 20 min、纖維素酶添加量2%。實際提取率75.7%，理論提取率75.1%，相對偏差0.79%，證明該模型可行，為杏鮑菇蛋白的提取提供了依據。杏鮑菇具有巨大的開發潛力，國內外學者對杏鮑菇的研究較少，因此，為了充分開發利用杏鮑菇，提高杏鮑菇深加工產業的發展仍需加大科研力度，完善杏鮑菇蛋白提取方法，符合工業生產要求，提高生產效率。