復合乳酸菌發酵淮山工藝優化研究

歐陽佳，蘭雪花，李清明，李雁含，曾璐，李文佳，蘇小軍，，3，*

（1.湖南農業大學食品科學技術學院，湖南長沙410128；2.生物質醇類燃料湖南省工程實驗室，湖南長沙410128；3.湖南省植物功能成分利用協同創新中心，湖南長沙410128）

淮山（Dioscorea opposita Thunb.）又名山藥，是薯蕷科薯蕷屬多年生薯蕷的塊莖[1]?；瓷阶鳛閭鹘y的藥食兼用食物，在我國有著上千年的食用歷史，中醫認為淮山有補脾養胃、生津益肺、固腎澀精的藥用功效[2-3]。乳酸菌是一類能利用糖類發酵產生乳酸的革蘭氏染色陽性細菌，部分乳酸菌已被證明具有抗氧化、提高機體免疫力、改善乳糖不耐癥和防治腹瀉等功效[4-8]。我國現有的乳酸菌發酵產品形式多樣，其中大部分為乳制品，包括發酵乳、酸奶、奶酪等；而針對果蔬進行乳酸菌發酵的研究也有一些報道，比如馬鈴薯、紫甘薯、胡蘿卜等[9-12]。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）是目前較為常用的兩種具有益生作用的乳酸菌[13-14]。在果蔬自然發酵過程中，植物乳桿菌屬于優勢菌種，具有較強的產酸能力和良好的耐酸性能；嗜熱鏈球菌來源于動物體內，容易適應腸道環境，便于人體消化[15-16]。

目前關于乳酸菌發酵淮山的研究較少，且主要是采用單一菌種，而以淮山為單一原料，采用復合菌種進行發酵的研究鮮有報道[17-18]。利用復合菌種進行發酵可以豐富相關產品中有益菌種類及其活性物質，本文采用植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌組成的復合菌種對淮山進行發酵，并對發酵工藝進行優化，旨在為淮山復合益生菌發酵產品的開發提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 材料

淮山：產自湖南雙峰縣；嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌：由湖南農業大學食品科學技術學院保藏。

1.1.2 試劑

M17肉湯（生化試劑）：青島高科技工業園海博生物技術有限公司；MRS肉湯、技術瓊脂粉（均為生化試劑）：廣東環凱微生物科技有限公司；α-1，4-葡萄糖水解酶（1.0×104U/g）、α-淀粉酶（3700 U/g）：北京索萊寶科技有限公司；蔗糖、檸檬酸、無水乙酸鈉、無水乙醇、乙酸、氯化鈉、蒽酮、濃硫酸（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；磷酸鹽緩沖液：福建廈門海標科技有限公司；葡萄糖標準品：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

GI54DWS型自動壓力蒸汽滅菌器：致微（廈門）儀器有限公司；HPX-30085-Ⅲ型恒溫恒濕箱：上海新苗醫療器械制造有限公司，PHS-3E型pH計：上海儀電科學儀器有限公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；WFJ 7200型可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；Centrifuge 5804 R高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 復合乳酸菌發酵淮山工藝流程

新鮮淮山→清洗→去皮→切片→護色（0.2%檸檬酸）→熱燙→磨漿[料液比 1∶4（g/mL）]→糊化（95℃，30 min）→酶解（55℃，3 h）→添加蔗糖→高壓蒸汽滅菌→接種→發酵

1.3.2 復合乳酸菌發酵淮山工藝單因素試驗

單因素試驗的因素固定水平為：發酵時間14 h、發酵溫度40℃、蔗糖添加量3%、菌株接種量5%、菌株接種體積比（嗜熱鏈球菌∶植物乳桿菌）1∶1，在此基礎上每次改變一個因素的水平值，考察發酵時間（10、12、14、16、18 h）、發酵溫度（36、38、40、42、44 ℃）、蔗糖添加量（1%、2%、3%、4%、5%）、菌株接種量（3%、4%、5%、6%、7%）和菌株接種體積比（1∶2、1∶1.5、1∶1、1.5∶1、2∶1）對活菌數和 pH 值的影響。

1.3.3 復合乳酸菌發酵淮山工藝正交試驗

根據單因素試驗的結果，選取發酵時間（A）、菌株接種量（B）和發酵溫度（C）進行正交試驗，考察其對復合乳酸菌活菌數的影響，確定發酵的最佳工藝條件。因素水平表見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of the experiment

1.3.4 發酵過程中多糖含量的測定

綜合單因素和正交試驗結果，在最優發酵條件下對淮山進行發酵。在發酵過程中，每隔3 h對發酵液中的多糖含量進行測定，并繪制24 h內多糖含量的動態變化曲線。

1.3.5 指標分析測定

pH值的測定：采用pH計直接測定。

活菌數的測定：采用平板菌落計數法。

多糖含量的測定參考蒽酮硫酸法[19]，具體操作如下。

樣品處理：吸取發酵液20 mL于100 mL錐形瓶中，超聲1.5 h，沸水加熱1 h；加入1 mL 10%α-淀粉酶溶液和0.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液于錐形瓶中，60℃水浴酶解1 h，再加0.4 mL 5%α-1，4-葡萄糖水解酶溶液，55℃酶解1 h，沸水滅酶；取5 mL上述溶液，加入 95%乙醇 20 mL，4℃放置 12 h，離心（5 000 r/min，10 min）；殘渣用80%乙醇洗滌，重復3次，殘渣即為粗多糖，加20 mL蒸餾水復溶。

樣品測定：吸取樣品溶液和蒸餾水各1mL于10mL具塞試管中，冰水浴條件下向試管中加入6 mL蒽酮硫酸試劑，沸水中反應15 min，取出搖勻，冷水中靜置7 min，490 nm處測吸光值。

2 結果與分析

2.1 不同發酵條件對淮山發酵的影響

2.1.1 發酵溫度對pH值和活菌數的影響

發酵溫度對pH值和活菌數的影響見圖1。

圖1 發酵溫度對pH值和活菌數的影響Fig.1 Effects of fermentation temperatures on pH value and viable count

過低或過高的溫度都會導致細胞內酶活下降，影響產酸能力和發酵速度，不利于乳酸菌的生長。從圖1可以看出，發酵溫度對活菌數和pH值的影響較大，在36℃～42℃的范圍內，隨著溫度的升高，活菌數呈現不斷增加的趨勢，并在42℃條件下活菌數達到最大值（8.23±0.02）lg（CFU/mL），繼續升高溫度時，活菌數開始下降；pH值則隨發酵溫度的升高不斷降低，后趨于穩定。嗜熱鏈球菌屬于嗜熱型微生物，細胞內的酶和蛋白質具有較強的抗熱性，能在50℃以內的溫度下生長；但植物乳桿菌屬于嗜溫微生物，溫度高于40℃時，細胞內酶的催化能力會大大降低，甚至會導致其喪失催化活性，從而影響菌株的正常生長[20]。因此，本試驗選擇42℃作為適宜發酵溫度。

2.1.2 發酵時間對pH值和活菌數的影響

發酵時間對pH值和活菌數的影響見圖2。

圖2 發酵時間對pH值和活菌數的影響Fig.2 Effects of fermentation time on pH value and viable count

發酵時間會影響乳酸菌發酵產酸量及發酵的完全程度[21]。在發酵過程中，乳酸菌利用淮山漿液中的糖作為碳源，在對數生長期內快速增長，同時產生大量有機酸。當有機酸積累到一定程度后，乳酸菌活力下降，同時基質中的營養物質被大量消耗，營養物比例逐漸失衡，使得其走向衰亡期。從圖2可以看出，隨著發酵時間的延長，活菌數先增加后減少，而pH值則呈現持續降低的趨勢。發酵14 h后，活菌數達到最高，為（8.43±0.06）lg（CFU/mL）。因此，在本試驗條件下，復合乳酸菌發酵淮山的適宜發酵時間為14 h。

2.1.3 菌株接種量對pH值和活菌數的影響

菌株接種量對pH值和活菌數的影響見圖3。

圖3 菌株接種量對pH值和活菌數的影響Fig.3 Effects of inoculation amount on pH value and viable count

接種量會影響菌株進入對數生長期的速度和菌株的生長周期[20]。從圖3可以看出，在菌株接種量增加的過程中，乳酸菌的活菌數呈現先增后減的趨勢，當接種量為4%時，活菌數達到最大值（8.89±0.03）lg（CFU/mL），此時pH值為4.05±0.01。菌株接種量較低時，乳酸菌繁殖基數小，活菌數增長緩慢，而加大接種量則能有效縮短延滯期，也能使淮山漿液中的營養物質被充分利用；但另一方面，淮山漿液所能提供的營養物質又是有限的，接種量過大會使得營養物質被過快消耗，同時產生大量的代謝產物，導致部分乳酸菌缺乏生長所需的能量，生長受到限制并提早進入衰亡期[22]。綜合考慮，本試驗選擇4%作為復合乳酸菌發酵淮山的適宜菌株接種量。

2.1.4 蔗糖添加量對pH值和活菌數的影響

蔗糖添加量對pH值和活菌數的影響見圖4。

從圖4可以看出，隨著蔗糖添加量的增加，乳酸菌的活菌數呈現先增后減的趨勢，在蔗糖添加量為2%～4%的范圍內，活菌數的變化波動較小。在此條件下，復合乳酸菌發酵淮山的適宜蔗糖添加量為3%。

嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌均能利用蔗糖作為碳源；但在氮源含量不變的情況下，單方面提高蔗糖添加量容易造成基質中的碳氮比失衡，從而導致乳酸菌提早衰亡；此外，蔗糖含量過高會造成高滲透壓環境，對乳酸菌有一定的脫水作用，可抑制其生長[4，23]。

圖4 蔗糖添加量對pH值和活菌數的影響Fig.4 Effects of sucrose content on pH value and viable count

2.1.5 菌株接種體積比對pH值和活菌數的影響

菌株接種體積比對pH值和活菌數的影響見圖5。

圖5 菌株接種體積比對pH值和活菌數的影響Fig.5 Effects of strain inoculation volume ratio on pH value and viable count

從圖5可以看出，嗜熱鏈球菌比例的增加會導致活菌數呈現先增后減的趨勢，并且在菌株接種體積比為 1∶1 時，活菌數達到最大值（8.63±0.04）lg（CFU/mL），此時pH值為4.34±0.01。

嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌之間存在種間共存關系，并且嗜熱鏈球菌屬于其中的優勢菌種[24]。接種后，嗜熱鏈球菌生長很快，較早進入對數生長期并且大量產酸，使得發酵體系的pH值快速下降，并會刺激植物乳桿菌的生長；但當接種比例過高時，嗜熱鏈球菌會迅速消耗基質中的營養物質，影響后期植物乳桿菌的生長，導致復合菌株之間的促生長能力降低和活菌總數下降。因此本試驗選擇菌株接種體積比為1∶1進行下一步研究。

2.2 復合乳酸菌發酵淮山工藝優化

為了進一步優化發酵工藝，根據單因素試驗的結果，選取發酵時間、發酵溫度和菌株接種量進行正交試驗，考察它們對乳酸菌活菌數的影響。正交試驗結果見表2。

表2 正交試驗結果Table 2 The results of orthogonal test

由表2可知，對發酵體系中活菌數的影響因素依次為A>C>B，最佳方案為A3B2C1，即發酵時間16 h、菌株接種量5%、發酵溫度40℃。在最優條件下進行3組重復驗證試驗，試驗結果表明發酵結束后體系中乳酸菌活菌數為（8.62±0.02）lg（CFU/mL）。與正交試驗結果基本相符，證明結果可信。黃天等[21]采用Lactobacillus plantarum P-8和Bifidobacterium lactis V9發酵淮山，在發酵時間19.1 h、發酵溫度37℃的條件下活菌數可達到8.63 lg（CFU/mL）；劉聰慧等[10]采用保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌和動物雙歧桿菌發酵馬鈴薯，在接種量5%、各菌種間接種體積比為1∶1、發酵溫度40℃的條件下活菌數可達到8.97 lg（CFU/mL），本試驗取得了與之相近的研究結果。

2.3 發酵過程中多糖含量的動態變化

發酵過程中多糖含量的動態變化見圖6。

淮山多糖是淮山中主要的活性成分，包含均多糖、雜多糖和糖蛋白，其中均多糖主要由葡萄糖構成，雜多糖主要由葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖等單糖構成[2，25]。嗜熱鏈球菌在發酵過程中能利用乳糖、果糖、蔗糖和葡萄糖產酸，植物乳桿菌在發酵過程中能利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、纖維二糖、木糖、果糖等產酸[4，26]。從圖6可以看出，隨著發酵時間的延長，發酵體系中的多糖含量呈現不斷下降的趨勢。這可能是因為淮山多糖在乳酸菌發酵過程中被水解利用[4]。在發酵前期，乳酸菌生長處于延滯期，對營養物質的利用較低，此時淮山多糖含量變化不大；在發酵3 h～15 h內乳酸菌活菌數呈現對數增長，多糖含量則顯著降低；在發酵15 h之后乳酸菌的活菌數趨于穩定，而多糖含量的變化也同樣趨于穩定，說明乳酸菌活菌數的增加與淮山多糖的減少密切相關，證明乳酸菌可以利用淮山多糖作為其營養物質。

圖6 發酵過程中多糖含量的動態變化Fig.6 Dynamic change of polysaccharide content during fermentation

3 結論

本試驗結果表明，以植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌組成的復合乳酸菌在單一的淮山漿液中能很好地進行發酵，活菌數超過8.00 lg（CFU/mL）；通過工藝優化，確定了較優的工藝條件，提高了發酵體系中的活菌總數；同時，發酵過程中多糖含量的動態變化證明乳酸菌可以利用淮山多糖，為淮山復合乳酸菌發酵產品的研究和開發提供參考和依據。