miRNA-200s表達對慢性阻塞性肺疾病（COPD）EMT影響的研究

朱敏 來依寧 高靜

【摘要】 目的 ?探討miRNA-200s表達改變對EMT的影響。方法 ?WS誘導體外COPD模型， 分別轉染miRNA-200s模擬物或者抑制劑，以轉染對照miRNA模擬物為對照組，觀測細胞形態學變化，運用免疫組織化學，蛋白印跡以及Real time-PCR檢測EMT相關指標的表達改變， 運用Sircold assay檢測培養細胞分泌的Col I。結論 ?WSC誘導EMT現象，miRNA-200c抑制劑促進EMT發生，而miRNA-200c模擬劑則減少EMT發生。

【關鍵詞】miRNA-200s 慢性阻塞性肺疾病（COPD）EMT

【中圖分類號】R322.3 ? 【文獻標識碼】A ? ?【文章編號】2107-2306（2020）03-086-01

慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種以不完全可逆的氣流受限為病變特征的疾病【1】。其病因機制復雜多樣，僅在最近幾年，研究人員已在人肺組織和氣道中觀察到上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）現象【2。3】。氣道上皮細胞可能通過EMT獲得間充質細胞表型，并成為成纖維細胞和肌成纖維細胞等促纖維化細胞的重要來源。尤其Sohal和Milara等已經在二手香煙引起COPD病人SAR的樣本中發現了EMT的證據。因此，EMT已成為SAR最重要的一個分子機制。本文旨在探究miRNA-200s表達改變對EMT的影響，研究如下：

研究內容、方案及技術路線

（1）研究內容

探究miRNA-200s表達改變對EMT的影響。

（2）實驗結果

miRNA-200c表達改變對EMT的影響：WSC刺激培養的16HBE，體外誘導COPD模型，分別進行miRNA-200c的過表達和低表達（分別轉染miRNA-200c 模擬物和抑制劑），以control miRNA模擬物為對照。相差顯微鏡下觀察各組細胞的形態學改變，結果顯示正常細胞呈典型的上皮細胞形態，經WSC激后，細胞形態明顯拉長，由典型的卵石狀上皮表型轉化成纖維細胞樣的間質表型，相鄰細胞間連接也變得疏松，呈現EMT狀態。加入miRNA-200c抑制劑后，上述現象消失，細胞回歸正常上皮細胞狀態。當加入miRNA-200c抑制劑時，細胞再次出現EMT現象;蛋白印跡結果顯示，經WSC刺激后，SEC23A表達增加，加入miRNA-200c模擬劑可以特異性抑制SEC23A的表達，而使用miRNA-200c抑制劑則促進SEC23A表達明顯上調。EMT相關標記蛋白表達結果顯示：經WSC激后，細胞上皮型標記蛋白E-cat表達下調，間質型標記蛋白Vimentin表達上調，說明WSC誘導EMT現象，而加入miRNA-200c抑制劑則進一步促進EMT發生，而miRNA-200c 模擬劑則減少EMT發生，促進TME的發生。Sircol soluble collagen assay檢測顯示：miRNA-200c 模擬劑可降低WSC刺激引起的Collagen I分泌增加，而miRNA-200c抑制劑則促進Collagen I分泌進一步增加。

討論

EMT的發生與多種蛋白分子，微環境以及MicroRNA等有關，除了常見的誘導因子例如轉化生長因子TGF-β等，細胞外基質的主要成分I型膠原（Type I collagen，Col I）也是誘導EMT的重要原因。Col I不僅能誘導胚胎發育中EMT的發生【4】，還可以通過整合素連接激酶依賴性激活NF-kB和淋巴增強因子-1來促進腎臟近曲小管上皮發生EMT【5】，從而在腎纖維化中發揮作用。另有研究小組發現Col1a1基因敲除所導致的EMT異常在小鼠顱面部發育中起著相當重要的作用【6】。體外研究表明，細胞培養在Col I涂層的培養皿中能誘導EMT的發生，而在正常或者其他涂層的培養皿中則沒有出現該現象【5，7】。Sun等發現香煙提取物促進氣道上皮分泌的生長因子LL-37能激活間充質細胞分泌大量的Col I，成為COPD小氣道重塑的重要機制。Zhou等研究發現樹木煙霧促進小氣道膠原蛋白尤其是Col I沉積，同時有EMT的形成。上述研究結果強烈提示，Col I高分泌，進而導致EMT發生，可能在COPD小氣道重塑中起著關鍵的作用。同時，Sircol soluble collagen assay檢測顯示：miRNA-200c 模擬劑可降低WSC刺激引起的Collagen I分泌增加，而miRNA-200c抑制劑則促進Collagen I分泌進一步增加。綜上研究，miRNA-200c抑制劑促進EMT發生，而miRNA-200c模擬劑則減少EMT發生。

參考文獻

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[7]Shintani Y， Hollingsworth MA， Wheelock MJ， Johnson KR. Collagen I promotes metastasis in pancreatic cancer by activating c-jun nh（2）-terminal kinase 1 and up-regulating n-cadherin expression. Cancer Res 2006， 66：11745–11753.

作者簡介：朱敏，出生年月：1978.8，性別：女;民族：漢;籍貫：湖北武漢;職稱：主任醫師;最高學歷：博士;研究方向：呼吸與消化病理及精準醫療

基金項目：該項新疆維吾爾自治區自然科學基金（2016D01A020）