濕熱-痰結-瘀毒型小鼠腸癌模型的建立

曹文　周小青

〔摘要〕 目的 建立一種濕熱-痰結-瘀毒的大腸癌動物模型，為中醫藥預防大腸癌實驗的多方位多角度開展提供模型保障。方法 將60只雄性小鼠隨機分為實驗A組、B組及C組，每組20只。A組腹腔注射氧化偶氮甲烷（Azoxymethane， AOM） 12.5 mg/kg;B組腹腔注射AOM 10 mg/kg ;C組一直為空白組，腹腔注射等量生理鹽水，均1次。隨后A、B兩組行3個循環周期，自由飲用2.5%葡聚糖硫酸鈉5 d+自由飲用無菌用水16 d為1個循環周期;C組自由飲用無菌用水，3組均采用高脂顆粒飼料喂養。造模結束后，斷頸處死小鼠觀察其瘤體組織變化。結果 與C組比較，A組和B組的造模前后的體質量差異有統計學意義（P<0.05），B組體質量變化大于A組（P<0.05）;A組腺癌成癌率較高，B組腺瘤成瘤率較高，差異均有統計學意義（P<0.05）;造模過程中A組死亡率大于C組，差異有統計學意義（P<0.05）。組織病理學顯示A組腺癌細胞排列紊亂，乳頭內間質少;B組腺瘤細胞排列呈大小不一的管狀結構，腺上皮細胞數目增多，核細長，呈不同程度的異型性。結論 AOM 10 mg/kg劑量組適合腺瘤（痰結）模型，AOM 12.5 mg/kg更適合惡性腫瘤（瘀毒）模型。

〔關鍵詞〕 結直腸癌;中醫證候模型;氧化偶氮甲烷;高脂顆粒飼料

〔中圖分類號〕R273? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.01.009

〔Abstract〕 Objective To establish an animal model of colorectal cancer with damp-heat， phlegm-stagnation， stasis-toxin， and to provide model guarantee for the experiment of preventing colorectal cancer by traditional Chinese medicine （TCM）. Methods A total of 60 male mice were divided into an experimental group A （n = 20）， a group B （n = 20）， and a group C （n = 20）. Group A was given intraperitoneal injection for AOM 12.5 mg/kg. Group B was given intraperitoneal injection for AOM 10 mg/kg. Group C was the blank group and was given intraperitoneal injection for the same amount of normal saline， all for once. Subsequently， Group A and B performed 3 cycles， and free drinking of 2.5% dextran sodium sulfate for 5 d + free drinking of sterile water for 16 days was a cycle; Group C had free drinking of sterile water for 3 cycles， and all of the 3 groups had high-fat pellet feed. After the modeling was completed， the mice were sacrificed by breaking neck to observe their tumor tissue changes. Results Compared with the group C， the differences in body weight before and after modeling were statistically significant in group A and group B （P<0.05）. The change in body weight in group B was greater than that in group A （P<0.05）; The adenocarcinoma formation rate of group A was higher， and the adenocarcinoma formation rate of group B was higher. The differences were statistically significant （P<0.05）. The mortality of group A was greater than that of group C during the modeling process， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Histopathology showed disordered arrangement of adenocarcinoma cells in group A with less interstitial nipples; adenoma cells in group B had tubular structures of different sizes， increased number of glandular epithelial cells， slender nuclei， and different degrees of atypical. Conclusion AOM 10 mg/kg dose group is suitable for adenoma （phlegm-stagnation） model， and AOM 12.5 mg/kg is more suitable for malignant tumor （stasis-toxin） model.

〔Keywords〕 colorectal cancer; TCM syndrome model; azomethane; high-fat pellet feed

結直腸癌是我國消化系統常見腫瘤，近30年來，結直腸癌的發病率年均上升3%～4%，我國結直腸癌發病率和死亡例數卻分別占全世界發病和死亡總例數的18.6%和20.1%，均居第1位[1]。研究發現，80%以上的結直腸癌是由結直腸腺瘤演變發展而來，結直腸腺瘤被認為是重要的結直腸癌的癌前病變[2]。正常的結直腸上皮細胞在炎癥、酒精等因素作用下過度增生，形成向腸腔突出的隆起性病變，由早期腺瘤向晚期腺瘤發展，并最終形成惡性腫瘤，即結直腸癌的“腺瘤-癌序貫學說”。中醫學認為大腸癌是濕熱-痰結-瘀毒的演變過程，與“腺瘤-癌序貫學說”吻合。且中醫藥抗癌在預防腫瘤復發方面大有前途，但目前臨床研究最常用的結直腸癌動物模型是移植瘤模型，盡管該模型成瘤率高，但不能模擬我們中醫腫瘤病理病機演變過程，限制了中醫藥預防及抗腫瘤復發轉移實驗的進行。而嚙齒類動物模型模擬腺瘤-癌的發病過程，更接近人類大腸癌發病機制[3]。研發濕熱-痰結-瘀毒的大腸癌動物模型，可為中醫藥預防大腸癌實驗提供多方位多角度模型保障。

本課題采用高脂飲食聯合氧化偶氮甲烷（Azoxymethane， AOM）及葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium， DSS）模擬腸炎誘導腸癌發生過程。國內大多數資料報道均是用AOM 10 mg/kg腹腔注射1次，然后自由飲用2%～3%的DSS 5 d，3～4周期[4-6]。國外相關文獻AOM 10～15 mg/kg腹腔注射1次較多[7-8]，為了使造模成功率更高，穩定性更好，我們在本課題探索了兩種AOM劑量，分別是10.0、12.5 mg/kg，DSS采用中間值2.5%的濃度，現就造模方法及結果報道如下。

1 材料

1.1? 主要試劑

AOM（美國Sigma公司，產品型號：A5486-25MG）;葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium salt， DSS）（上海甑準生物科技有限公司，產品型號：ZZR-0216011

080）;無菌用水﹑0.9%生理鹽水、蘇木精染液、10%中性福爾馬林固定液均由湖南省中醫藥研究院附屬醫院病理科提供。

1.2? 主要設備

電子秤（上海舜宇恒平科學儀器有限公司，型號：FA1004）;低溫超速離心機（上海力申科學儀器有限公司，型號：Neofuge 23R）;石蠟切片機（德國萊卡公司，型號：RM2235）;病理組織烘烤儀（泰維科技，型號：TK-218）;顯微鏡及攝像系統（OLYMPUS公司，型號：BX41）;鑷子、剪刀、注射器、手套、棉簽、離心管由湖南省中醫藥研究院附屬醫院腫瘤中心實驗室提供。

1.3? 實驗小鼠

C57BL/6雄性小鼠，60只，6周齡，體質量18～22 g，SPF級，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司（實驗動物生產許可證號：SCXK（湘）2016-0002，實驗動物合格證編號：43004700041870，實驗單位使用許可證編號：SYXK（湘）2015-0008）。

1.4? 飼養環境

飼養室保持良好通風，控制環境溫度22～24 ℃，濕度40%～60%，12 h循環光照，高脂顆粒飼料喂養，自由飲水，實驗室適應性飼養1周后，自第2周開始實驗。

2 方法

2.1? 動物分組及造模方法

60只小鼠購置飼養1周后，隨機分為實驗A組，B組和C組，每組20只。A組腹腔注射AOM 12.5 mg/kg，B組腹腔注射AOM 10 mg/kg，C組腹腔注射等量生理鹽水，均1次，隨后A、B兩組分別自由飲用2.5% DSS 5 d，其余時間飲用無菌用水，21 d為1循環周期，分別循環3個周期，C組一直飲用無菌用水，均用高脂顆粒飼料喂養。造模結束，禁食1 d后，將小鼠斷頸處死。

2.2? 模型小鼠指標觀察

2.2.1? 各組小鼠一般體征觀察? 每天觀察小鼠的毛發、大便量，每周測量小鼠的體質量，觀察是否存在血便，記錄小鼠死亡情況。

2.2.2? 組織病理學檢查? 在造模結束后，禁食1 d，頸錐脫臼法處死小鼠，將小鼠固定在小鼠固定架上，剖開腹腔，從盲腸末端到肛門處取下整段結直腸，用眼科剪縱向剖開腸管，用無菌生理鹽水清潔腸壁后，肉眼觀察有無瘤體，并在4%的多聚甲醛液中固定，石蠟包埋，病理切片，HE染色，顯微鏡下確定瘤體性質。

2.3? 統計學方法

所有數據均采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。計量資料結果以“x±s”表示，兩樣本均數比較采用成組t檢驗，定義檢驗水準a=0.05，以P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1? 各組小鼠的一般體征情況

在每個周期的最后一天測量小鼠的體質量，并計算第3周期造模成功后小鼠體質量與造模前的體質量差值，進行統計學分析，結果顯示：與C組比較，A組和B組小鼠體質量增長緩慢，其中A組最慢，差異統計學意義（P<0.01或P<0.05）。見表1。

在飲用DSS第1周期的第7天，A組和B組小鼠的大便次數均開始增多變稀，7 d后大便性狀恢復正常，而便次仍然多，兩組均未觀察到明顯血便。第1周期結束后，兩組小鼠毛發均有脫落，A組更嚴重。

3.2? 各組小鼠瘤體情況

肉眼觀察，A組可見腫瘤呈息肉狀向腸腔突出，伴淺表潰瘍，為腺癌。B組可見散發息肉，表面光滑，為腺瘤。實驗小鼠結直腸可見多個散在結節，直徑約0.1～0.5 cm。

與C組比較，A組和B組的腺癌成癌率、腺瘤成瘤率差異均有統計學意義（P<0.05）。A與B兩組比較，A組腺癌成癌率較高，B組腺瘤成瘤率較高，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表2。

3.3? 各組小鼠生存情況

實驗結束時，A組小鼠死亡7只，B組死亡4只，C組無死亡。A組死亡率與B組相比，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

3.4? 各組小鼠瘤體組織學變化

顯微鏡下觀察，可見腺癌細胞排列紊亂，乳頭內間質少，見圖1A。而腺瘤細胞排列呈大小不一的管狀結構，腺上皮細胞數目增多，核細長，呈不同程度的異型性，見圖1B。正常腺體見圖1C。

3.5? 該動物模型在成模過程中的證候演變

注射AOM前小鼠活潑好動，注射藥物后，小鼠精神萎靡，蜷縮活動減少，倦怠乏力，飲用DSS后，小鼠大便次數增多變稀，毛發脫落，體重明顯減輕，特別是A組。參照中醫診斷學[12]，按照中醫方法學-類比法，注射藥物前小鼠為平和質，給予高脂飲食聯合AOM及DSS后，小鼠為濕熱-痰結-瘀毒證型。在實驗動物具體表現為：造模第1周期濕熱證：小鼠腹瀉、便次增多，伴有黏液，肛門發紅;第2周期痰結證：大便性狀恢復正常，但便次仍多，部分小鼠出現腺瘤;第3周期瘀毒證：大便次數減少，腺瘤癌變，小鼠體質量明顯減輕，為惡病質。

4 討論

嚙齒類動物模型是臨床實驗最常用的動物模型，模擬濕熱-痰結-瘀毒型結直腸癌發病機制的動物模型對結直腸癌中藥新藥的研發有重要的意義。

據周鳳等[13]報道，高脂飲食聯合AOM及DSS誘導法更符合臨床脂代謝異常與腸息肉發病的密切相關性。每個周期的第1天給小鼠腹腔注射AOM（10 mg/kg），連續3周期，并飲用3%DSS水3 d+滅菌水4 d，第4周期后只飲用3%DSS水3 d+滅菌水4 d，重復6個周期，高脂飼料和DSS同步干預。第9個周期所有小鼠均出現腹瀉、稀便，部分小鼠有肉眼血便，不典型增生發生率為75%。該模型造模周期短，說明高脂飲食可以加重AOM及DSS誘導的小鼠UC及其不典型增生。該方法的缺點為不能模擬腺癌的發生。另張華月等[14]報道，AOM與DSS聯合誘導法，第1天腹腔注射AOM（12.5 mg/kg），第6天起連續5 d飲用2.5%DSS水，21 d為1周期，循環3周期。第4周小鼠出現急性黏膜炎和畸形腺窩灶，7周出現腺瘤中-重度不典型增生改變，14周出現腺癌。該造模方法較好地模擬人類腸炎向腸癌進展過程，但缺點是造模時間過長。

我們目前需要一種既能較好模擬人類腸炎向腸癌進展過程又周期相對較短的動物模型。徐德魁等[15]報道，高脂飲食后，脂類在消化道代謝過程中產生的一些產物，如次級膽酸、硫化氫等可損害大腸黏膜，破壞腸道內微環境，引起菌群失調，導致黏膜炎癥。黏膜損傷，腸道細菌可移位到腸黏膜內，激發炎癥反應對結腸組織進一步破壞。本實驗采用了AOM+DSS誘導造模的優點及高脂飲食破壞腸道的特點，用高脂飲食聯合不同劑量的AOM+2.5% DSS造模，發現：如果用AOM 10 mg/kg劑量，腺瘤成瘤率較高，本次實驗為68.75%，用AOM 12.5 mg/kg，腺癌發生率較高，約69.23%，但注射AOM時需嚴格掌握劑量，劑量超過，將直接導致小鼠腸道壞死，小鼠大量死亡。

中醫認為，大腸癌是在內外因素作用下，由濕熱、瘀毒等浸淫腸道所致。濕邪致病具有纏綿難愈的特性，并可嚴重阻滯氣機，濕邪在腸癌的發生發展過程中具有特殊作用。濕邪阻滯日久，氣血失調，氣滯可阻津，進而生痰，氣滯痰阻又可礙血運行，出現瘀血，進而痰瘀互結，遷延難愈，久而成毒，于是菀郁壅遏，化為癌腫。痰結是由濕熱發展為瘀毒的中間過程，在此過程中，濕熱可化生為有形之邪——痰，結直腸癌是由結直腸腺瘤（痰結）演變發展而來，結直腸腺瘤被認為是重要的結直腸癌的癌前病變。上述實驗過程顯示，結直腸癌形成的3個周期可能為濕熱-痰結-瘀毒。

綜上所述，由高脂飲食聯合AOM和DSS模擬的炎性結直腸癌小鼠模型符合中醫大腸癌濕熱-痰結-瘀毒的演變過程，AOM 10 mg/kg劑量組適合腺瘤模型，AOM 12.5 mg/kg更適合惡性腫瘤模型，且9周成功造模。本實驗為中醫藥物研究結直腸癌提供了相對成熟的模型，對研發預防和治療結直腸癌的中藥新藥提供了模型保障，具有一定的科學價值。

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（本文編輯? 蘇? 維）