高通量測序法對苯胺類染化廢水中微生物菌群多樣性的試驗研究

董煥成，買文寧,呂志栓

（1.喀什大學土木工程學院，喀什844000；2.鄭州大學生態與環境學院,河南鄭州450001）

苯胺能夠和血紅蛋白相結合生成高鐵紅蛋白，從而可使血紅蛋白和氧的結合力降低，導致動物出現中毒的現象，對生物體造成嚴重程度上的危害[1]。苯胺是一種嚴重污染環境以及危害人體生命健康的有害物質，有一定的致癌性[2]。印染，塑料，農藥，醫藥等工業生產的廢水都含有較高濃度的苯胺[3]。苯胺類染化廢水一般呈黃棕色，如果不經處理直接排入水體中，會對水體環境造成污染，進而危害到人類的健康。

高通量測序技術，也稱深度測序、“下一代”測序技術，一次能夠對幾十萬條乃至上百萬的DNA分子來進行測定，并且其一般讀長比較短，另外能夠對一個物種的基因組及轉錄組進行細致地全貌分析[4,5]。而且高通量測序直接對微生物進行測定，不需要進行培養，能夠更加客觀地反映微生物菌群的多樣性[6]。本試驗通過用高通量測序法對反應進程中活性污泥微生物菌群多樣性的變化進行研究，探討苯胺類染化廢水對活性污泥中微生物群落的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗用水取自新鄉某染化公司，其COD 為30000mg/L，BOD5為12000mg/L，NH3-N 為12.16mg/L，SO42-為70480mg/L，SS 為600mg/L，pH 為11.03，含鹽量為17%。實驗所接種的好氧污泥TS 為5.81 g/L，VS/TS 為54.47%。

1.2 實驗裝置

試驗所用總體積為9L 的反應器，其有效容積6 L。進水采用瞬時進水法、排水采用虹吸排水法。反應過程中通過內置曝氣頭進行曝氣。

1.3 實驗方法

在反應器內通入4L 實驗用水、2L 好氧污泥，使其充分混合接觸，溫度為室溫，pH 值控制在7.5左右，每天定時取樣測定其COD 值，當隨著每次進水后COD 值達到不變時，可看作一個運行周期。試驗所用的污泥樣品分別于第0、3、6 周期取樣，并分別編號1 號、2 號、3 號。對3 個樣品委托上海生工生物有限公司進行高通量測序，對微生物菌群多樣性的變化進行分析。

2 結果與討論

2.1 OTU 分析

對3 個污泥樣品進行高通量測序，測序結果如表1 顯示序列長度大部分分布在400～600bp 之間，平均長度為440bp，可以看出測序結果比較好。為提高后續的質量分析和數據可靠性，對原始序列進行去接頭、質量剪切等處理[7]。在過濾低質量以及短長度序列之后，反應初期污泥樣品中有36461 個序列，其平均長度415。中期有36907 個序列，其平均長度410。后期有47661 個序列，其平均長度408。后經去嵌合體及靶外序列，初期有31874 個序列，中期有25031 個序列，后期有26253個序列。共獲83158 條，并聚類于12356 個OTU。

表1 3 個污泥樣品的高通量測序數據

通過圖1 統計三個樣品中共有和獨有的OTU數目，直觀展現出活性污泥中微生物多樣性和豐度，由圖1 可以看出，反應三個階段的OTU 數目分別為8303、2115 和1938 個，其中三個污泥樣品的共有OTU 數為112，特有OTU 數分別為7888、1325 和1305。反應初期和中期污泥樣品的共有OTU 數為342，反應初期和后期污泥樣品的共有OTU 數為185，反應中期和后期污泥樣品的共有OTU 數為560。

圖1 VENN 圖

2.2 α-多樣性分析

三個樣品的微生物菌群通過α-多樣性分析的各項指標如表2 所示。由表2 可得，在97%的分類水平上，覆蓋率值均>83%，能夠真實地反映污泥樣品中微生物群落的信息。反應初期的Shannon 指數7.50 比中期4.76 和后期4.96 大，Chao1 指數19705 比中期5517 和后期4348 大，ACE 指數32516 比中期8029 和后期6551 大，而Simpson 指數0.0042 比中期0.0421 和后期0.0324小，因此反應初期的微生物菌群多樣性與中后期不同，其復雜程度隨著反應進程明顯降低，也說明微生物菌群多樣性在逐漸減少。

2.3 Beta 多樣性分析

Beta 多樣性分析結果顯示樣品之間微生物菌群的相似度[8]。對三組樣品進行樣本聚類分析，結果顯示反應中、后期污泥中微生物菌群組成的相似度可達88.75%，與反應初期相比差異較大。由圖2 和圖3 中同樣可得，反應中、后期在圖中較為聚集，表明其相似度較高。而反應前期距離中、后期均較遠，表明其相似度較低。

表2 3 組污泥樣品的α-多樣性指數

圖2 樣本聚類圖

圖3 PCoA 分析（2dplot）

3 結論

本試驗以苯胺類染化廢水為研究對象，通過高通量測序法對微生物菌群的多樣性進行OTU分析、Alpha 多樣性分析、Beta 多樣性分析。結果表明，通過利用苯胺類染化廢水對活性污泥進行馴化，微生物菌群多樣性在不斷減少，隨著反應周期的增加，微生物組成的差異性不斷降低，污泥中細菌群落變化較為顯著，即可能會促進某些微生物菌群的增長繁殖，同時也可能抑制部分細菌生長。