麻黃中麻黃堿和偽麻黃堿提取的教學(xué)實(shí)驗(yàn)改進(jìn)

梁 倩 許忠偉 王 芳 王大瑋 王 猛 劉蔚漪

西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南 昆明 650224

麻黃為麻黃科植物草麻黃(Ephedrasinicastapf)、中麻黃(EphedraintermediaSchrenket C.A.Mey.)和木賊麻黃(Ephedra.equisetinaBge.)的干燥草質(zhì)莖[1]。始載于漢代《神農(nóng)本草經(jīng)》，歷代本草均有收載。麻黃作為常用中藥，味苦澀，因具有發(fā)汗解表、止咳平喘及利水的功效而廣泛用于臨床。麻黃中含有多種生物堿，一般含量為1%～2.5%，主要成分為D-(-)麻黃堿(70%～80%)和L-(+)偽麻黃堿，二者互為立體異構(gòu)體，結(jié)構(gòu)如圖1所示，氮原子連在側(cè)鏈上，屬于有機(jī)胺類生物堿[2]。麻黃堿主要作用為平喘，偽麻黃堿主要作用為消炎及選擇性收縮呼吸道毛細(xì)血管[3]。

麻黃中麻黃堿和偽麻黃堿的提取方法有三種：利用麻黃堿和偽麻黃堿在溶劑中溶解度不同的甲苯溶劑法；利用二者游離狀態(tài)時具有揮發(fā)性的水蒸汽蒸餾法；利用堿性強(qiáng)弱不同的離子交換樹脂法[4]。水蒸氣蒸餾法提取產(chǎn)率低，且濃縮過程時間長，高溫致使部分麻黃堿分解，影響提取生物堿的質(zhì)量[5-6]；離子交換樹脂法因投資大，樹脂的清洗時間過長和其它工藝問題也不常用[6]，因此甲苯溶劑法一般作為學(xué)生教學(xué)實(shí)驗(yàn)。《植物化學(xué)》、《生物活性天然產(chǎn)物的分離》、《藥用植物資源開發(fā)與利用》、《天然產(chǎn)物化學(xué)》、《天然藥物化學(xué)》等課程都可將此實(shí)驗(yàn)作為學(xué)生綜合實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)涵蓋加熱提取、抽濾、萃取、減壓蒸餾、生物堿的分離、結(jié)晶、點(diǎn)板、顯色等內(nèi)容，實(shí)驗(yàn)過程可有效鍛煉學(xué)生的綜合實(shí)驗(yàn)?zāi)芰Α⒄铡堵辄S堿提取與鑒定》[2]的實(shí)驗(yàn)過程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時，發(fā)現(xiàn)麻黃粉水煮以后過濾困難，沒有明確的提取溫度，萃取用的甲苯易燃、易爆、有毒致癌，萃取時乳化嚴(yán)重，薄層色譜展開劑的Rf值偏小，鑒定現(xiàn)象不明顯等諸多問題，嚴(yán)重影響教學(xué)效果。因此，為了制定快速、容易操作及顯色明顯的實(shí)驗(yàn)操作過程，對提取麻黃堿和偽麻黃堿的實(shí)驗(yàn)從粉碎粒度、提取溫度、提取次數(shù)、萃取溶劑、分離方法、鑒定檢識方法等方面進(jìn)行實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 草麻黃、鹽酸麻黃堿(純度100%)標(biāo)準(zhǔn)品、鹽酸偽麻黃堿標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.8%)、粉碎機(jī)、勺子、圓底燒瓶、水浴鍋、冷凝管、線手套、濾紙、玻璃棒、pH試紙，分液漏斗、漏斗、鐵架臺、毛細(xì)管、硅膠板、鉛筆、尺子、氯仿、草酸、氫氧化鈉、氯化鈣、濃氨水、無水乙醇、碘、茚三酮、碘化鉍鉀、溴甲酚綠、濃硫酸、正丁醇、異丙醇、抽濾瓶、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、循環(huán)水式真空泵。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 麻黃堿的提取 傳統(tǒng)提取方法：①稱取25 g麻黃粗粉，放入500 mL圓底燒瓶中；②加入250 mL水；③加熱回流提取20 min；④過濾。殘?jiān)?50mL水再提取一次，合并兩次提取液，用20%的NaOH調(diào)pH值為11～12。

改進(jìn)點(diǎn)：①“稱取25 g麻黃粉”改為稱取30g麻黃粉；②“加入250 mL水”改為加入300 mL水；③“加熱回流提取20 min”改為80～90 ℃熱水提取20 min；④“過濾”改為抽濾。

1.2.2 鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的分離 堿化后的溶液轉(zhuǎn)入分液漏斗中：①加50 mL甲苯萃取3次，合并甲苯萃取液，將其轉(zhuǎn)入分液漏斗；再分別加50 mL 2%的草酸溶液萃取兩次，合并草酸萃取液，減壓濃縮至約20 mL，低溫冷卻30 min，使結(jié)晶析出，濾取結(jié)晶即為草酸麻黃堿，草酸偽麻黃堿則留在母液中。把草酸麻黃堿置于燒杯中，加入飽和CaCl2溶液10 mL，加熱至沸。②然后冷卻后抽濾，收集濾液。③在濾液中加入濃鹽酸，調(diào)節(jié)其pH值為5～6，靜置，晶體析出后過濾，即得鹽酸麻黃堿。④在攪拌下，給前述母液中加入適量飽和CaCl2溶液至不再有沉淀析出時為止，抽濾。⑤向抽濾后的濾液，滴加濃鹽酸調(diào)節(jié)其pH值為5～6。⑥水浴濃縮至原體積的1/2，靜置析晶，過濾后即得鹽酸偽麻黃堿。

改進(jìn)點(diǎn)：①“然后加50 mL甲苯萃取3次，合并甲苯萃取液，將其轉(zhuǎn)入分液漏斗”；改為“然后加等體積的氯仿萃取兩次，合并氯仿萃取液，將其轉(zhuǎn)入分液漏斗” ；②“然后冷卻后抽濾，收集濾液” 改為 “然后冷卻后過濾，收集濾液”； ③“在濾液中加入濃鹽酸，調(diào)節(jié)其pH值為5～6，靜置”改為 “靜置”； ④“在攪拌下，給前述母液中加入適量飽和CaCl2溶液至不再有沉淀析出時為止，抽濾”，將“抽濾”改為“過濾”； ⑤“向抽濾后的濾液，滴加濃鹽酸調(diào)節(jié)其pH值為5～6”省略該步；⑥“水浴濃縮至原體積的1/2”改為“減壓濃縮至原體積的1/2”。

改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)流程圖如圖2所示。

圖2 鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的提取分離流程圖

1.2.3 麻黃堿的鑒定 二縮脲試驗(yàn):取麻黃堿鹽少許，溶于1 mL水中，加入5滴CuSO4試劑，振蕩后再加入10滴20%NaOH試劑，即顯藍(lán)紫色。加入2 mL乙醚，水層變?yōu)樗{(lán)色，醚層為紫紅色，即表明有麻黃堿存在。改進(jìn)點(diǎn)：取消二縮脲試驗(yàn)鑒定麻黃堿。

薄層色譜鑒定：利用活化過的硅膠G薄層板，對麻黃堿和偽麻黃堿進(jìn)行鑒定。展開劑為：1%氨水：異丙醇(1∶9)，顯色劑為茚三酮試劑。改進(jìn)點(diǎn)：展開劑為：異丙醇-正丁醇-氨水(15.7∶2∶2.5)，顯色劑：碘單質(zhì)在常溫下30 s至2 min顯色。茚三酮試劑在105～110 ℃，2～7 min顯色。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)過多次探索試驗(yàn)，對傳統(tǒng)甲苯溶劑法提取、分離麻黃堿和偽麻黃堿過程中的主要步驟進(jìn)行了如下優(yōu)化：麻黃粉碎后過30目篩，80～90 ℃熱水提取，抽濾，氯仿等體積萃取，分離時不需要用鹽酸酸化，異丙醇-正丁醇-氨水(15.7∶2∶2.5)作展開劑，效果最好(見圖3 H)，碘單質(zhì)在常溫下30 s至2 min，茚三酮試劑在105～110 ℃，2～7 min鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿顯色最明顯(見圖3 N、O)。

3 討論

3.1 提取方法改進(jìn)的原因 麻黃中的生物堿通常以鹽的形式存在于麻黃草植物細(xì)胞壁內(nèi)的環(huán)狀纖維上，且麻黃細(xì)胞壁質(zhì)地堅(jiān)韌，因此將麻黃粉碎，過30目篩，提高提取效率[7]。麻黃中麻黃堿的提取方法主要有煎煮法[8]、水浴溫浸法及冷浸法[8]，還有冷凍滲漉法[8]、微波法[8]、超聲提取法[8]、索氏提取法[9]、振蕩提取法[9]等。提取溶劑主要為水(或者加酸酸化)，還有有機(jī)溶劑乙醇、甲醇和乙醚[9]，丙酮[10]等。提取效率：水煎煮回流法>酸性乙醇回流提取法>溫浸法>[11]超聲提取法[8]>其他提取方法。陳柳蓉等[12]對麻黃提取麻黃堿和偽麻黃堿的提取溫度、提取次數(shù)、酸度和提取時間進(jìn)行考察，認(rèn)為提取溫度對提取率影響顯著，其次是提取次數(shù)，酸度和提取時間等影響較小。水煎煮法提取液溫度越高，萃取時越容易乳化[13]，高溫也會使麻黃堿分解，因此提取溫度設(shè)置為80～90 ℃熱水提取。麻黃中的鞣質(zhì)成分較多，水提后過濾困難，采用抽濾的方法進(jìn)行過濾，可以節(jié)省時間，提高效率。

3.2 麻黃堿和偽麻黃堿分離改進(jìn)的原因 李德玉等[6]對氯仿、乙酸乙酯、甲苯、石油醚、乙醇為萃取溶劑，萃取麻黃堿和偽麻黃堿的效率進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)氯仿與提取液體積比為1∶1萃取兩次，萃取效率最高。抽濾改為過濾的原因是因抽濾比過濾損失要多，損失率為17%。

省略鹽酸調(diào)節(jié)pH值為5～6，是因?yàn)闉V液本身的pH值就已經(jīng)為3～4，不需要再用HCl調(diào)節(jié)。水浴濃縮改為減壓蒸餾，是因?yàn)樗饪s時間較長，規(guī)定時間內(nèi)不能按時完成實(shí)驗(yàn)。

3.3 麻黃堿的鑒定

3.3.1 二縮脲試驗(yàn) 麻黃堿和偽麻黃堿與大多數(shù)生物堿沉淀試劑不發(fā)生反應(yīng)，麻黃堿與堿性CuSO4生成的銅絡(luò)鹽因反應(yīng)靈敏度不高，甚至看不到顯色。因此不能用二縮脲試驗(yàn)鑒定麻黃中的生物堿。

3.3.2 薄層色譜鑒定

3.3.2.1 展開劑的選擇 展開劑為：1%氨水-異丙醇(1∶9)[2](實(shí)驗(yàn)書上的展開劑)展開時(見圖3 A)，Rf值偏小，不能有效區(qū)分麻黃堿和偽麻黃堿。《中國藥典》對麻黃堿和偽麻黃堿的展開劑用氯仿-甲醇-氨水(20∶5∶0.5)[1]，展開結(jié)果見圖3 B，也是不能區(qū)分麻黃堿偽麻黃堿。因此對包括藥典在內(nèi)的13種關(guān)于麻黃堿和偽麻黃堿的展開劑進(jìn)行了篩選，展開劑為：A.1%氨水-異丙醇(1∶9)(見圖3 A)[2]； B.氯仿-甲醇-氨水(20∶5∶0.5[1]，20∶ 3.5∶ 0.25[14]，100∶8∶1[15]，10∶2∶0.1[16])(見圖3 B)；C.氯仿-正丁醇-水(10∶4∶0.5)[17](見圖3 C)；D.氯仿-醋酸乙酯-甲醇-水(13∶40∶22∶10)[18](見圖3 D)；E.氯仿-醋酸乙酯-甲醇-氨水(15∶4∶3∶0.3)[19](見圖3 E)；F.乙醇-氯仿-水-氨水(10∶1∶4∶0.5)[20](見圖3 F)；G.氯仿-正丁醇-乙醇(1∶1∶1.5)[21,22](0.5 mol/L 氫氧化鈉噴霧堿化)(見圖3 G)；H.異丙醇-正丁醇-氨水(15.7∶ 2∶ 2.5)[23-25](見圖3 H)；I.正丁醇-乙酸乙酯-水(4∶ 1∶5)的上層溶液[26](見圖3 I)；J.正丁醇-乙醇-水(24∶ 12∶ 4)[27-29](見圖3 J)；K.正丁醇-冰醋酸-水(8∶2∶1)[30](見圖3 K)；L.乙酸乙酯-甲醇-氨水(15∶5∶2[31]； 17∶2∶1[32])(見圖3 L)；M.正丁醇-甲醇-水(6∶2∶1)[33](見圖3 M)。其中展開劑H：異丙醇-正丁醇-氨水(15.7∶ 2∶ 2.5)能有效區(qū)分鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿(見圖3 H)，其它的展開劑均不能區(qū)分(圖3：A-M及O均為茚三酮顯色，N為碘顯色)。

3.3.2.2 顯色劑的選擇 薄層色譜展開后，用茚三酮試劑顯色，沒有指明顯色溫度，常溫下不顯色。因此對生物堿顯色試劑及常見顯色劑：碘、碘化鉍鉀、茚三酮、硫酸乙醇和溴甲酚綠進(jìn)行顯色實(shí)驗(yàn)。碘單質(zhì)在常溫下30 s至2 min，鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿顯色明顯(見圖3 N)，茚三酮試劑在105～110 ℃，2～7 min鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿顯色明顯(見圖3 O)，碘化鉍鉀、硫酸乙醇和溴甲酚綠試劑對鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿不顯色。

圖3 A-M為不同展開劑的茚三酮顯色色譜圖

4 討論

麻黃堿中的氮原子是連接在支鏈上而不是連接在苯環(huán)上，與大多數(shù)生物堿試劑不發(fā)生反應(yīng)，所以本實(shí)驗(yàn)對常用生物堿試劑進(jìn)行篩選，找到對麻黃堿和偽麻黃堿顯色明顯的生物堿試劑。麻黃中麻黃堿的含量較低，一般為1%～2.5%，因此在實(shí)驗(yàn)中要求提取、分離麻黃堿的實(shí)驗(yàn)條件均需達(dá)到最優(yōu)，否則薄層色譜很難檢測到生物堿的存在，本實(shí)驗(yàn)對麻黃中麻黃堿和偽麻黃堿提取、分離方法進(jìn)行改進(jìn)后提高了麻黃堿的提取效率，今后可以利用植物的親緣關(guān)系或者活性成分化學(xué)結(jié)構(gòu)的相似性尋找麻黃堿含量較高的植物資源，代替麻黃資源做該提取實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)過程經(jīng)過多次操作驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象明顯，科學(xué)規(guī)范，能有效提高學(xué)生實(shí)驗(yàn)的積極性，加深學(xué)生對本次實(shí)驗(yàn)的思考和認(rèn)識，增強(qiáng)學(xué)生的動手能力，有效提高教學(xué)質(zhì)量。