滴陰炎婦科洗液制備工藝優選及質量標準研究

劉 軍 李文靜 柳 茜 劉本臣 董亞楠 張麗媛

寧夏回族自治區銀川市中醫醫院,寧夏 銀川 750001

滴蟲性陰道炎是婦科領域常見病，其病情纏綿，不易速愈，且常并發月經不調、閉經、不孕等疾病。滴陰炎婦科洗液的中藥成分(由苦參、蛇床子、白鮮皮、仙鶴草等)具有清熱燥濕、殺蟲的功效，用于治療白帶增多、外陰瘙癢等癥，療效顯著[1]。筆者前期采用高速離心及無機陶瓷膜超濾技術對我院使用30余年，組方精當的院內制劑“滴陰炎熏洗液”進行工藝改進，改善了原制劑澄清度不高的問題[1]。氯己定屬于雙胍類化合物，有較強廣譜抑菌、殺菌作用且毒性小，性質穩定，常被作為消毒有效成分廣泛應用于消毒產品中，一般用于手、皮膚和黏膜的消毒[2-6]。

本研究擬在前期研究基礎上將葡萄糖酸氯己定(CHG)與原中藥制劑復配二次開發為“消準字號”產品并建立質量標準，擴大其殺菌范圍，達到較高效能消毒劑水平，達到服務更廣泛人群及產品產業化目標。

1 材料

1.1 儀器 JW-T-1.OB-316陶瓷膜設備(江蘇久吾高科技股份有限公司，膜材料Al2O3，膜面積0.5m2；離心泵，Q=5.8 m3/h)、XU12WZT-1C 型光電濁度儀(北京中西遠大科技有限公司)，立式自動壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫療器械廠)，電子天平(METTLER TOLEDO*S205)、磁力攪拌器IKARCT digital(德國IKA)，DHG-6050 型真空干燥箱(上海一恒科技有限公司)，臥式冷藏冷凍轉換器(Haier)BC/BD-100HEGW、BPC-150F生化培養箱(上海一恒科技有限公司)、MJ-1500-II霉菌培養箱(上海一恒科技有限公司)、定性濾紙片(5 mm圓形)、無菌棉拭子、游標卡尺、微量移液器(10～100 μL，艾本德上海國際貿易有限公司)；

1.2 試藥 試驗菌種為大腸埃希菌(CMCC(B)44102，批號3a28-1)、金黃色葡萄球菌(CMCC(B)26003，批號：5a31-2)、白色念珠菌(CMCC(F)98001，批號2a17-2)；營養瓊脂培養基(190328)、沙堡瓊脂培養基(161219)、胰蛋白胨大豆瓊脂培養基(190414)；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 處方工藝優選

2.1.1 原液除雜工藝優選 相比于傳統的醇沉工藝，超濾技術是精制滴陰炎熏洗液的一種有效方法，超濾技術的優勢在于有效成分轉移率高，生產周期短，省去大量乙醇溶劑。本文前期以蛇床子素、氧化苦參堿的轉移率為指標，采用1∶8生藥濃度滴陰炎提取液以孔徑為500 nm的Al2O3無機陶瓷膜進行滴陰炎熏洗超濾液制備[1,4]。

2.1.2 增溶劑優選 氯己定難溶于水，多采用溶解度好的胍鹽，如醋酸氯己定、鹽酸氯己定和葡萄糖酸氯己定。預試驗發現，在滴陰炎超濾液中直接加入0.2%CHG后溶液立即變渾濁，故需添加增溶劑來改善溶解度。聚山梨酯毒性小、無刺激性，對許多有機藥物都有較好的增溶效果，且對藥物在皮膚和黏膜的吸收具有一定的促進作用[7-8]，泊洛沙姆對皮膚黏膜無刺激性和過敏性，能增強難溶性藥物的溶解度，可供肌肉、皮下、靜脈注射應用。精密稱取20 mL超濾液，分別用吐溫-80、泊洛沙姆108、泊洛沙姆407作為增溶劑，45 ℃、500 r/min攪拌至溶解，加入一定濃度CHG，攪拌均勻靜置。同一濃度下，12 h后觀察溶液物理變化(如顏色變化、澄清度變化)，發現吐溫80的增溶澄清效果優于泊洛沙姆系列，故選擇吐溫80為增溶劑。采用單因素考察，加入1%、2%、3%、4%吐溫-80，以CHG含量為指標，按照“2.2.1”測定，優選吐溫-80最佳比例。結果見討論。

2.2 含量測定

2.2.1 液相條件：色譜柱: Agilent-C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm); 流速: 1.0 mL/min; 柱溫:28 ℃; 進樣量: 10 μL；流動相: 0.02 moL/L磷酸二氫鉀水溶液(磷酸調pH至2.5)-乙腈(65∶35); 波長:254 nm。

2.2.2 對照品母液制備：精密稱取醋酸氯己定對照品適量，加80%乙醇制成1.721 mg/ml的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備：精密量取滴陰炎超濾水液(生藥比1∶8)20 mL，加入吐溫-80、CHG適量，完全溶解后，加入適量保濕劑β-葡聚糖，攪拌均勻后，用乳酸調至pH值3.7～4.5，定容至25 mL量瓶，待用。

2.2.4 陰性溶液的制備: 精密量取20 mL水溶液代替滴陰炎超濾液，按”2.2.3”項下的方法操作制備得陰性對照溶液。

2.2.5 標準曲線制定：取“2.2.2”對照品母液0.1、0.25、0.5、0.6、0.8、0.9 mL，用80%乙醇定容至10 mL量瓶，按“2.2.1”液相條件測定得線性回歸方程Y=23.129X+2.9009，r2=0.9999(線性范圍在17.21～154.8 μg/mL)；

2.2.6 專屬性實驗：分別取對照品、供試品及陰性對照溶液，按“2.2.1”項下的色譜條件分析。結果表明：供試品與對照品在相同的保留時間有相同色譜峰，且分離度良好為6.03(大于1.5)，其理論塔板數為8535。陰性無干擾。結果如圖1所示。

A.空白溶液 B.陰性對照品液 C.醋酸氯己定對照品 D.供試品溶液

2.2.7 樣品制備與測定 樣品前處理優化：精密吸取洗液1 mL，加入0 mL、0.2 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL、3 mL、5 mL的1 moL/L H2SO4后再用純水定容至25 mL，結果顯示當加入1 moL/L H2SO4≤2 mL時，隨著加入量的增加，測得CHG有所增加；當加入1 moL/L H2SO4>2 mL之后，CHG的峰面積無明顯變化；故選在滴陰炎婦科洗液樣品前處理時先加入2 mL的1 moL/L H2SO4。結果如圖2所示。

圖2 1 moL/L H2SO4不同加入量對GHG含量的影響

樣品制備與測定:精密吸取 1 mL滴陰炎婦科洗液于25 mL 量瓶，加入2.0 mL 的1 moL/L H2SO4溶液，搖勻，加80%乙醇稀釋至刻度，超聲(40HZ)15 min，0.22 μm 濾膜濾過后，照“2.2.1”項法進行液相測定。計算公式:C樣=(C對×A樣/A對)×稀釋定容倍數×1.43。三樣品中葡萄糖酸氯己定含量為0.199% g/mL。

2.3 抑菌試驗 參照《消毒技術規范》2002年版中“2.1.8.2”[13]，以抑菌圈的大小為指標，采用濾紙片法考察“2.2.”滴陰炎抑菌制劑對易引起陰道炎的3種致病菌(白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌)的抑菌能力。結果見圖3及表1。

A.金黃色葡萄球菌 B.大腸埃希菌 C.白色念球菌

表1 滴陰炎婦科洗液對3種致病菌的對應抑菌結果

3 討論

3.1 增溶劑的選擇 葡萄糖酸氯己定為陽離子表面活性劑，在皮膚的消毒上具有持續抗菌活性[5]。堿性物質如肥皂、陰離子表面活性劑、某些銀離子藥物能降低其殺菌效果[6]。吐溫-80 是帶有雙官能團陰-非離子復合型表面活性劑，具有陰離子和非離子型表面活性劑的雙重特點，在水中有良好的溶解性，同時有較好的起泡能力，抗硬水、無機鹽能力，且對人體無刺激性反應，對CHG有良好的促溶作用，是較理想的增溶劑[8]。本研究以CHG含量及溶液澄清度為評價指標對吐溫-80、泊洛沙姆407加入量(1%、2%、3%、4%)進行考察，結果顯示：吐溫-80不同比例對應的CHG峰面積分別為(865.9、944.2、1277.8、1527.8)，表明加入吐溫-80的滴陰炎婦科洗液中2%～3%之間溶解度明顯增加，而3%～4%溶解度增加不明顯。而泊洛沙姆407不同比例對應的CHG峰面積分別為(1326.8、1310.2、1350.7、1387.0)，12 h后觀察溶液物理變化(如顏色變化、澄清度變化)，發現吐溫80的增溶澄清效果優于泊洛沙姆系列。綜合考慮澄清度和性狀，選擇加入3%吐溫80。

3.2 CHG含量測定及抑菌試驗 本研究對比了紫外分光光度測定與高效液相測定方法，結果表明紫外分光光度計測定結果偏高，且可能由于中藥成分在同一波長對其有吸收，測定不穩定且偏高。而HPLC測定靈敏度及專屬性高，較為穩定，更適合滴陰炎婦科洗液的含量測定，故選用HPLC測定方法對CHG進行跟蹤并作為質量控制標準之一。抑菌環實驗顯示滴陰炎婦科洗液對3種致病菌均有抑菌作用，但對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌抑菌效果優于白色念珠菌。

滴陰炎婦科洗液適用于婦科疾病預防及治療，本研究創新性地將傳統滴陰炎熏洗液經超濾處理后二次開發婦科洗液，具有良好的市場應用和開發價值。后期將進一步對該洗液進行陰道黏膜刺激等研究，以期將其開發為消毒產品，擴大其使用范圍。