YAP通過增加HIF-1α轉錄活性進而促進小鼠下肢缺血后動脈生成*

李智昱， 李夢琦， 張成虎， 李博川， 何金龍， 梁德剛△， 艾 玎△

（1天津醫科大學生理學與病理生理學系，天津醫學表觀遺傳學協同創新中心，天津300070；2天津醫科大學總醫院心血管外科，天津300052）

下肢外周動脈疾病（peripheral arterial disease，PAD）在全世界影響超過兩億人，部分PAD患者存在嚴重肢體缺血，可導致行走能力的缺失和生活質量的降低，造成社會巨大經濟負擔。PAD治療的基礎是血管重建，以防止肢體壞死和功能障礙［1］。動脈生成是由血管內皮細胞等介導的側支血管重建的過程［2］，在缺血性疾病中的治療作用不可或缺。

缺氧誘導因子1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）是缺氧反應的主要轉錄介質，可以直接或間接調節血管內皮細胞中2%以上的基因，通過促進血管生成、動脈生成、血管重塑等過程來控制氧和營養物質的輸送［3］。研究表明，HIF-1α活性的高低與小鼠下肢缺血后血流灌注情況相關［4-6］，但其轉錄活性調控的具體分子機制目前尚不十分清楚。

Hippo-Yes相 關 蛋 白（Yes-associated protein，YAP）信號通路在進化過程中高度保守，經典Hippo通路通過一系列激酶反應最終導致下游效應分子YAP/具有PDZ結合基序的轉錄輔激活因子（transcriptional coactivator with PDZ-binding motif，TAZ）絲氨酸位點的磷酸化，進而促進YAP/TAZ降解或者在細胞漿中滯留，從而在控制器官大小、腫瘤生長等過程中發揮重要調控作用［7］。近年來研究發現Hippo-YAP信號通路在心血管疾病中同樣至關重要［8］，如YAP可以介導血流動力學導致的內皮激活，進而促進動脈粥樣硬化發生發展［9］，內皮細胞YAP也可以通過與信號轉導和轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）相結合，進而促進乳小鼠視網膜血管新生過程［10］。YAP為輔轉錄因子，通過與TEAD等轉錄因子結合發揮轉錄調控活性［7-8］。已知在腫瘤細胞中，YAP和HIF-1α可以相互結合［11］，但YAP是否可以在內皮細胞中調控HIF-1α仍然未知。

在本研究中，我們構建內皮細胞特異性YAP過表達（EC-YAPtg）小鼠下肢缺血模型，試圖探究YAP促進動脈生成的分子機制，旨在為PAD的治療提供新的潛在靶點。

材料和方法

1 動物和細胞

CAG-loxP-STOP-loxP-YAP1轉基因小鼠（YAPflox）以及內皮特異性Tie-2啟動子表達CRE的小鼠購于南京大學-南京生物醫藥研究院。EC-YAPtg小鼠為以上兩種小鼠雜交所得。實驗使用6～8周齡雄性小鼠。人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）從天津醫科大學總醫院產科提供的臍帶中分離獲得；HEK293細胞購于ATCC（貨號CRL-1573）。

2 主要試劑

抗HIF-1α抗體（貨號79233）、抗總YAP（total YAP，t-YAP）抗體（貨號4912）和抗Ser127位點磷酸化 YAP（phosphorylated YAP at Ser127，p-YAPS127）抗體（貨號 4911）購于 Cell Signaling Technology；抗GAPDH 抗體（貨號 60004-1-lg）購于 Proteintech；YAP-WT和YAP-5SA質粒由浙江大學趙斌教授贈送。

3 主要方法

3.1 Western blot實驗 提取HUVECs蛋白，使用BCA試劑盒進行蛋白定量，進行SDS-PAGE（蛋白上樣量為20μg），轉移蛋白質到硝酸纖維素膜上。5%的脫脂奶粉封閉1 h，加入I抗并4℃孵育過夜，洗膜后II抗室溫孵育1 h，化學發光法檢測蛋白表達。使用ImageJ軟件分析YAP總蛋白以及其磷酸化蛋白水平，以GAPDH為內參照，最后進行統計分析。

3.2 免疫細胞化學染色 用PBS清洗實驗組和對照組細胞或組織，使用4%多聚甲醛固定0.5 h，0.5%Triton X-100室溫處理0.5 h，并使用山羊血清工作液室溫封閉1 h，加入I抗于4℃濕盒過夜；使用PBS清洗后再加入熒光II抗室溫孵育1 h，PBS清洗后使用含有DAPI染料的封片劑封片；使用激光共聚焦顯微鏡拍照分析。

3.3 免疫共沉淀實驗 提取HUVECs蛋白，使用BCA試劑盒進行蛋白定量；取500μg蛋白質樣品，加入特異性抗體，4℃孵育過夜；第2天加入瓊脂糖珠，4℃孵育過夜；最后加入SDS，100℃加熱5 min，再進行Western blot實驗。

3.4 螢光素酶報告基因實驗 將HIF-1α螢光素酶報告基因載體（由上海吉凱基因公司構建）與LacZ、YAP-WT和YAP-5SA質粒共轉染HEK293細胞24 h后，收獲細胞；按螢光素酶活性檢測試劑盒（Promega）說明書檢測HEK293細胞螢光素酶活性；最后用ImageJ軟件分析熒光強度，并進行統計分析。

3.5 激光多普勒血流儀檢測小鼠下肢血流 分別于結扎股動脈手術后1、8、15和22 d使用激光多普勒血流儀檢測小鼠下肢血流量情況。2組小鼠麻醉后仰臥，固定雙下肢，將多普勒光纖探頭固定至下肢，掃描并記錄下肢血流灌注情況。

4 統計學處理

采用GraphPad Prism 7.0軟件進行統計分析及作圖。實驗結果均以均數±標準誤（mean±SEM）表示。兩組間比較采用未配對雙尾t檢驗，多組間比較采用雙因素方差分析和Bonferroni校正后的t檢驗。以P＜0.05作為差異有統計學顯著性的標準。

Figure 1.Hypoxia reduced YAP phosphorylation and promoted YAP nuclear translocation.A：Western blot analysis of expression of indicated proteins；B：HUVECs were exposed to nomoxia or hypoxia for 6 h，and immunofluorescence staining for YAP（red）and DAPI（blue）was performed.The scale bar=20 μm.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs 0 h.圖1 缺氧降低YAP蛋白磷酸化水平并增加其核轉位

結 果

1 缺氧降低YAP磷酸化水平并增加其核轉位

隨著缺氧時間延長，HIF-1α的表達水平上調，同時YAP蛋白第127位絲氨酸磷酸化水平呈時間依賴性下降，4 h和6 h下降最為顯著（P＜0.05），而總YAP蛋白水平沒有明顯改變，見圖1A。免疫熒光染色結果顯示，缺氧處理6 h顯著增加YAP蛋白在細胞核的定位，見圖1B。

2 YAP和HIF-1α在內皮細胞中相互結合

既往研究顯示，YAP蛋白在肝癌細胞中可以和HIF-1α蛋白相互結合并促進細胞的糖酵解過程［12］，但內皮細胞中兩者是否存在結合尚不清楚。免疫共沉淀實驗結果顯示，在缺氧狀態下，內皮細胞YAP蛋白和HIF-1α蛋白存在相互結合，見圖2。

3 YAP上調HIF-1α的轉錄活性

在HEK293細胞中，將HIF-1α螢光素酶報告基因質粒分別與LacZ、YAP-WT和YAP-5SA質粒共轉染24 h后，檢測螢光素酶的活性，結果顯示，與對照質粒相比，YAP-WT質粒能有效增加HIF-1α的轉錄活性（P＜0.05），YAP-5SA質粒比YAP-WT質粒能進一步增加HIF-1α的轉錄活性（P＜0.05），見圖3。這表明YAP蛋白可以上調HIF-1α的轉錄活性。

4 YAP過表達可以促進缺氧組織的血流恢復

EC-YAPtg小鼠的構建過程如圖4A所示。對ECYAPTg小鼠和對照小鼠（YAPflox）行股動脈結扎手術，分別于術后1、8、15和22 d使用激光多普勒血流儀檢測小鼠下肢血流恢復情況。與YAPflox小鼠相比，EC-YAPtg小鼠下肢的血流灌注顯著增加（P＜0.05），見圖4B。這提示YAP蛋白過表達可以促進小鼠缺氧組織的血流恢復。

5 YAP能夠促進動脈生成

進一步提取EC-YAPtg小鼠和YAPflox小鼠腓腸肌并且進行免疫細胞化學染色檢測CD31、α-SMA及Mac3表達水平。相比于YAPflox小鼠，EC-YAPtg小鼠肌肉中CD31和α-SMA表達明顯增高（P＜0.05），而Mac3表達沒有明顯變化（P＞0.05），見圖5。這表明YAP過表達促進了缺血組織中動脈生成。

Figure 2.Identification of HIF-1α as YAP-binding partner.Coimmunoprecipitation（IP）assay was performed using extracts of HUVECs and anti-YAP/HIF-1α antibody.Rabbit normal IgG was used as control.Immunoblotting was performed with the indicated anti-HIF-1α or anti-YAP antibody.圖2 YAP蛋白和HIF-1α蛋白相互結合

Figure 3.YAP up-regulated the transcriptional activity of HIF-1α.HIF-1α promoter luciferase reporter plasmid was cotransfected into HEK293 cells with LacZ，YAP-WT or YAP-5SA plasmids for 24 h.The promoter activity was measured by luciferase reporter assay，which was normalized to β-galactosidase.Mean±SEM.n=5.*P＜0.05 vs LacZ group；#P＜0.05 vs YAP-WT group.圖3 YAP增加HIF-1α的轉錄活性

討 論

以上實驗結果證實，缺氧通過調控YAP第127位絲氨酸磷酸化而促進YAP入核與HIF-1α相互結合，并可能通過上調HIF-1α的轉錄活性，進而調控缺血后動脈生成過程。

HIF-1α在調節缺氧/缺血相關的疾病中被證實可以通過轉錄活性調控血管活性、血管新生、動脈生成，以及骨髓來源細胞的遷移和歸巢等過程，進而在疾病發生發展過程中發揮重要的調控作用［6］。研究證實HIF-1α可以作為細胞內的氧氣感受器存在：氧氣濃度增加時，HIF-1α被羥基化并與希佩爾-林道腫瘤抑制因子（von Hippel-Lindau tumor suppressor，VHL）相互作用，最終導致HIF-1α的泛素化修飾以及降解；缺氧時HIF-1α的羥基化修飾過程被抑制，進而泛素化修飾以及降解過程被抑制［13］。已有報道證實HIF-1α在缺血相關的動脈生成過程中發揮重要作用。HIF-1α+/-小鼠相比于對照鼠，其下肢缺血后血流恢復速度更慢，同時也發現HIF-1α作為轉錄因子，可以調控眾多與血管新生以及動脈生成相關的基因，包括血管生成素1（angiopoietin 1，ANGPT1）、ANGPT2、干細胞生長因子（stem cell growth factor，SCF）、基質細胞衍生因子1（stromal cell-derived factor-1，SDF1）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等［4］。因此，鑒于HIF-1α在血管新生以及動脈生成中的重要作用，使用藥物干預或者基因治療來提高HIF-1α的活性，可以成為治療缺血性疾病的新策略［3］。研究證實，通過局部注射CoCl2或者二甲基乙二酰基甘氨酸（dimethyloxalylglycine，DMOG）可以提高HIF-1α的表達進而改善損傷后的修復過程［5，14］。同時，腺病毒過表達持續激活形式的HIF-1α也可以促進2型糖尿病小鼠下肢缺血后血流恢復［15］。我們的研究證實了YAP可以與HIF-1α相互結合并且促進其轉錄活性，YAP可以作為內源性HIF-1α轉錄活性的激活蛋白存在。此外，通過構建EC-YAPtg小鼠我們也發現，內皮細胞YAP過表達可以改善小鼠下肢缺血后血流灌注情況，促進動脈生成。

血管生成，即從已有血管網中形成新的血管，常見于發育過程中［16］；動脈生成，是指現有的側支血管的擴張，內皮細胞增殖后，平滑肌細胞有絲分裂，彈性層內破裂，血管平滑肌細胞遷移形成新內膜，一般見于出生后動脈網的延伸或缺血損傷后天然微血管側支小動脈轉變為功能動脈等過程［17］。動脈生成與血管生成在觸發因素、參與細胞及分子調控等方面存在不同［17-19］。我們之前的研究以及他人的研究均發現YAP在VEGF信號通路調控過程中具有重要作用［10，20］，同時也證實了 YAP在血管內皮細胞中通過增加STAT3在細胞核的滯留時間進而增加ANGPT2的轉錄調控，從而促進乳小鼠視網膜血管新生過程［10］，但YAP是否在動脈生成過程中也發揮著重要調控作用尚不清楚。本研究中，我們采用經典的動脈生成模型［21］，而且小鼠腓腸肌冰凍切片免疫熒光染色的結果表明，相比于YAPflox小鼠，EC-YAPtg小鼠腓腸肌中成熟內皮細胞標志物CD31和血管平滑肌細胞標志物α-SMA［22］的表達水平明顯升高，巨噬細胞標志物Mac3無明顯變化。這一結果提示內皮細胞YAP可以促進動脈生成過程，促進小鼠缺血后下肢血流的恢復。

Figure 4.Over-expression of YAP promoted blood flow recovery in mice after hind-limb ischemia.A：loxP-flanked STOP cassette was used to control YAP expression in tissue by mating mice with an endothelial-specific Cre mouse line；B：hind-limb ischemia was surgically induced in EC-YAPtgmice and their wild-type littermates（YAPflox），and blood flow was evaluated by laser Doppler imaging on days 1，8，15 and 22.Mean±SEM.n=10.*P＜0.05 vs YAPfloxgroup on day 22.圖4 YAP過表達可以促進下肢缺血后血流恢復

Figure 5.YAP overexpression promoted arteriogenesis.Gastrocnemius was extracted from YAPfloxand EC-YAPtgmice after ligation of femoral artery.Immunofluorescence staining for CD31（red），α-SMA（green），Mac3（red）and DAPI（blue）was performed.The scale bar=100μm.Mean±SEM.n=10.*P＜0.05 vs YAPfloxgroup.圖5 YAP過表達促進下肢缺血后血管生成

綜上所述，缺氧刺激可調節YAP磷酸化水平進而促進YAP核轉位；YAP可以與HIF-1α結合并促進其轉錄活性；特異性內皮細胞過表達YAP可以促進小鼠下肢缺血后動脈生成過程。本研究為缺血后動脈生成過程的分子機制研究提供了新思路；同時提示缺氧誘導的YAP入核參與了下肢缺血后動脈生成過程，并可能成為新的治療靶點。