雷帕霉素促進缺血性腦卒中后神經血管單位修復*

吳致遠， 鄧儀昊， 張永杰， 何紅云

（昆明理工大學醫學院，云南昆明650500）

腦卒中（cerebral stroke）是一種由腦血管病變引起的、以腦組織損傷及相應神經功能缺陷為主要臨床表現的急性腦血管病，可分為缺血性和出血性2種，該病具有致殘率高、死亡率高和發病率高的特點［1］。我國每年腦卒中新發病例超過200萬，約有120萬人死于腦卒中相關疾病，腦卒中已經成為了家庭和社會的沉重負擔［2］。由于僅有的溶栓藥物組織纖維蛋白溶酶原激活劑（tissue plasminogen activator，tPA）治療有著嚴格的時間及其他禁忌癥的限制，加之缺血/再灌注時會再次造成腦損傷，所以尋找新的治療方法迫在眉睫［3］。腦卒中后缺血區神經元功能喪失是導致神經功能障礙的主要原因，因此挽救缺血區的神經元是卒中后恢復腦功能的重要措施。

神經元在體內并非孤立存在，其與周圍的血管、細胞等共同組成神經血管單位（neurovascular unit，NVU）［4］。NVU由神經元、內皮細胞、周細胞、星形膠質細胞、巨噬細胞/小膠質細胞、平滑肌細胞、細胞外基質等組成，能夠維持血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）的結構與功能，介導神經-血管的耦合，調節血管張力［5］，控制血-腦間的物質交換，對維持循環系統及大腦內環境的穩定起著至關重要的作用［4］。大量研究表明，雷帕霉素（rapamycin）具有神經保護作用，因此本文就雷帕霉素對缺血性腦卒中后NVU的作用及機制進行綜述。

1 缺血性腦卒中導致的NVU損傷

NVU在腦卒中的發病過程中具有重要意義［6］。缺血性腦卒中發生后，血流停止便開始發生一系列級聯反應，并隨著時間和空間的推移而發生變化，導致神經細胞的損傷及水腫的形成［7］。在缺血性腦卒中的超急性期，細胞出現線粒體功能受損、pH值下降、ATP合成受損、離子泵活性降低等現象，最終酸性的環境、Ca2+和Na+的積累及水分的流入導致了細胞的腫脹和死亡［8］。這些損傷發生的同時，一些內源性的保護機制，比如神經元的自噬同時被激活［9］。而從NVU的水平來看，損傷主要發生在以下幾方面：一是BBB被破壞，缺血后內皮細胞、周細胞和星形膠質細胞間的緊密連接消失，細胞質基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）釋放增加［10］；二是炎癥反應，通過實驗檢測到梗死發生后腦組織中輔助性T細胞與調節性T細胞失衡，免疫炎癥反應被激活［11］，周細胞還能分泌許多損傷相關分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）和諸如白細胞介素一類的炎癥因子以啟動機體的非感染性免疫及炎癥過程［12］；三是毛細血管阻塞，在中風的超急性期后，周細胞的收縮導致毛細血管阻塞（產生無回流現象），并進一步增加BBB的通透性，促進腦水腫的形成［13］。

2 缺血性腦卒中后雷帕霉素對NVU的調節作用

雷帕霉素的化學結構為疏水性的大環內酯，臨床上用于腎移植患者的免疫抑制及罕見病淋巴管平滑肌肌瘤病的治療［14］。雷帕霉素在體內與FKBP-12蛋白相結合產生復合物，該復合物能夠與哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）相結合，并抑制mTOR的活化［15］。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，擁有mTORC1和mTORC2兩種復合物，但只有mTORC1對雷帕霉素敏感，其在調節細胞的生長和增殖、調控核糖體RNA的轉錄及核糖體的生物發生、抑制自噬、調節脂質合成等諸多方面發揮作用［16］。而mTORC2通過調控蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）、血清和糖皮質激素調節激酶1（serum and glucocorticoid-regulated kinase 1，SGK1）、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）等蛋白質的磷酸化，控制細胞生存，調控細胞骨架［17］。總之，mTOR在細胞的生長及代謝中扮演著極為重要的角色，它的失調與大量的疾病有關［18］。

2.1 雷帕霉素提高NVU中神經元的自噬水平 神經元是NVU的重要組分。腦卒中發生后，缺血區損傷神經元面臨壞死、凋亡和自噬3種命運。位于缺血中心區神經元在腦中風后數分鐘內即發生壞死，但在缺血周圍區即缺血半影區，NVU內的星形膠質細胞能與神經元建立聯系并向其輸送線粒體進行能量代償，大大緩解其的生存壓力［19］。此時，誘導這些細胞選擇自噬途徑將有助于神經元的保護。使用雷帕霉素進行缺血前處理可以誘導腦缺血/再灌注過程中的自噬，并在存活率、大腦梗死面積、神經行為學評分等方面表現出優勢［20］。在永久性缺血的模型中，缺血預處理可以減少梗死面積，當使用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）處理時，雷帕霉素的保護效果消失［21］。由此可見，雷帕霉素能夠通過激活神經元自噬緩解缺血所帶來的損傷，從而起到神經保護作用。利用神經元靶向的轉錄因子EB（transcription factor EB，TFEB）過表達治療自噬-溶酶體障礙能夠減輕缺血性腦卒中所產生的損傷［22］。相反，有研究認為在神經元缺血的情況下自噬具有損傷作用，抑制自噬也能夠起到神經保護的作用［23］。這意味著缺血性腦卒中后自噬對神經元的調節具有雙重作用。那么，雷帕霉素誘導的自噬是否會減輕缺血性損傷？使用雷帕霉素和氯喹進行處理后發現二者都能減小大腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠的梗死面積，改善神經行為學評分，但僅有雷帕霉素治療組的大鼠存活率得到提升，這說明在卒中后藥物誘導自噬比抑制自噬更有利于其治療［24］。另有薈萃分析指出：低劑量的雷帕霉素治療能夠更有效減小梗死體積，這可能是通過誘導最佳的自噬水平而起到神經保護作用［25］（圖1A）。

2.2 雷帕霉素提升NVU的血流量 NVU中血流量的提升可以極大減輕腦卒中后的功能障礙。雷帕霉素能夠顯著改善NVU中的血流情況。在阿爾茨海默病模型中，雷帕霉素抑制mTORC1后可以提升腦血流量，恢復腦血管密度，維持BBB的完整性并改善行為表現［26］，其機制被證實為雷帕霉素抑制mTOR后導致內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）活性升高，從而擴張血管［27］（圖1B）。另一項研究評估了在體內利用雷帕霉素治療中風后的腦血流量，顯示再灌注2 h的腦血流量沒有顯著改善，梗死面積增加［23］，可能是因為長期（3 d）且大劑量（20 mg/kg）注射雷帕霉素抑制了對細胞應激反饋和生存所至關重要的mTORC2［28］。平滑肌細胞在調節腦血管張力、血管完整性和腦穩態方面起著至關重要的作用［29］。而再灌注后機體自我調控能力減弱與mTOR通路可能有關。在嚙齒動物MCAO模型中，栓塞30 min后開始出現自主調控的衰弱，并一直持續到24 h，表明MCAO大鼠大腦中動脈的自我調控能力衰減程度與圍繞著動脈的平滑肌細胞細胞骨架重排列程度呈正相關［30］。另有實驗證實，雷帕霉素亦能通過抑制人橫紋肌肉瘤細胞系中RhoA的表達，減少細胞骨架的重組及細胞運動，因此雷帕霉素可能是通過限制大腦動脈中平滑肌肌動蛋白細胞骨架的重排來緩解動脈自我調控能力的衰減，從而減少對NVU的毒害作用［31］（圖1C）。

2.3 雷帕霉素減少NVU的無回流現象 對大鼠MCAO術后的預后狀況評估發現，再灌注時的血流量比缺血時的血流量更加重要［32］。而缺血發生后，毛細血管隨著周細胞一同收縮，中性粒細胞、血小板、紅細胞等堆疊將導致無回流或低回流現象［33］，因此減少NVU中無回流現象的發生對缺血性腦卒中后神經功能的恢復具有重要意義。無回流現象的發生是由于缺血發生后大量Ca2+進入到周細胞胞質，激活了Ca2+/肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC）激酶途徑，誘導周細胞的快速收縮［34］。雷帕霉素通過對mTOR的抑制，可以降低MLC對鈣的敏感性，緩解缺血時大量Ca2+內流誘導的周細胞收縮所致的毛細血管堵塞，從而發揮神經保護作用［31］（圖1D）。

2.4 雷帕霉素促進NVU對BBB結構與功能的維持 NVU對BBB的結構與功能的維持具有重要意義。腦卒中發生后，周細胞與血管相分離，此時周細胞和內皮細胞的胞間連接消失［12］，周細胞還將釋放MMPs，這將再次誘導緊密連接蛋白復合物的解聚與重組，進一步增加BBB的通透性［35］。同時星形膠質細胞出現細胞毒性，表現為細胞脹大，水孔蛋白（aquaporin，AQP）及膠質細胞原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）的 表 達增加［36］，伴MMPs的釋放增加［37］。這些病理變化都使得BBB的完整性受到破壞，血管通透性增加，導致腦水腫的發生。雷帕霉素和不依賴mTOR途徑的自噬誘導劑碳酸鋰在氧糖剝奪（oxygen-glucose deprivation，OGD）模型和MCAO模型中均表現出有利于保持BBB完整性的作用［38］。在一個糖尿病及MCAO的復合模型中，雷帕霉素能夠在栓塞1 h和再灌注2 h內降低非糖尿病大鼠BBB的通透性［39］。體外的細胞培養實驗證明，BBB的損傷是由PKC-β調控的RhoA/Rho激酶/MLC2通路所造成的［40］。抑制Rho激酶能夠調節內皮細胞的應激反應，增加細胞間緊密連接，從而改善MCAO大鼠BBB的完整性［41］。mTOR位點對Rho激酶通路至關重要，因此雷帕霉素既可通過提高內皮細胞的活力，亦可通過直接穩定細胞骨架及保持細胞間的緊密連接來改善BBB的完整性。BBB破裂時，周細胞通過缺血激活的p38絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑釋放MMP-9，從而破壞 BBB［42］。雷帕霉素可以通過上調MAPK磷酸酶1（MAPK phospatase-1，MKP-1）的表達來抑制p38 MAPK的活性［43］，從而抑制MMP-9和AQP4的表達，減少梗死體積，并維持BBB的完整性［44］（圖1D）。盡管雷帕霉素對于星形膠質細胞和周細胞MMP的釋放作用機制仍有待完善，但雷帕霉素在維持缺血性腦卒中患者BBB穩定性上依舊表現出了巨大的潛力。

2.5 雷帕霉素調控NVU的炎癥細胞以促進神經保護 卒中發生后，NVU中的內皮細胞因為細胞因子細胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）、血管細胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）、P-/E-選擇素和 MMPs的表達上調，促使其向炎癥表型轉化［45］。同時小膠質細胞源性巨噬細胞（microglia-derived macrophages，MiDM）和單核細胞源性巨噬細胞（monocytederived macrophages，MoDM）將會浸潤腦組織，它們分為促炎的M1型和抗炎的M2型。在腦缺血發生后的不同時期，巨噬細胞將會向2個不同的方向極化，卒中發生后的5 d內M2表型占據優勢，此后則是M1表型為主導［46］。高濃度的炎癥因子會導致動脈粥樣硬化斑塊的破裂和閉塞性血栓的形成，進一步加劇腦的損傷，腦卒中后有效的炎癥過程對預后非常重要［47］。體內MCAO模型顯示，雷帕霉素通過抑制mTOR促進巨噬細胞從M1型向M2型的轉變，并上調Arg-1和YM-1基因的表達，從而抑制炎癥反應［48］（圖1E）。缺血時調節性T細胞與巨噬細胞/小膠質細胞的相互作用能夠調節炎癥的進程，而雷帕霉素能夠增強調節性T細胞的抗炎活性，從而降低小膠質細胞的促炎能力［49］。鑒于血流能將外周器官中的多種物質輸送到大腦，因此我們還需要關注雷帕霉素作用于外周時的作用：腦卒中后大量的中性粒細胞會遷移到病灶，血小板和中性粒細胞在腦部毛細血管的聚集將會導致血管再通后的低灌注現象，而雷帕霉素具有抗中性粒細胞和抗血小板的活性，有利于卒中的預后［50］。

Figure 1.Neuroprotective effect of rapamycin（Rapa）on neurovascular unit（NVU）in ischemic stroke.mTOR：mammalian target of rapamycin；BBB：blood-brain barrier；MLC：myosin light chain；MAPK：mitogen-activated protein kinase；MMP-9：matrix metalloproteinase-9；AOP4：aquaporin 4.圖1 雷帕霉素在缺血性腦卒中對神經血管單位的神經保護作用

3 小結

NVU在大腦的正常生理活動中發揮著重要的作用，缺血性腦卒中將導致NVU中多種組分發生功能障礙及病理改變。實驗室中已經證實了雷帕霉素能夠通過多種方式對缺血后的NVU進行調控從而達到神經保護的效果。但由于mTOR作為哺乳動物體內的一個高保守位點，其涉及調控多條信號通路，關乎細胞的營養、代謝、生長、發育等諸多方面［51］，因此我們在考慮使用雷帕霉素作為神經保護劑治療腦卒中時，還必須進一步摸清其具體作用機制、給藥時間窗口、最佳劑量以及可能的副作用等。綜上所述，盡管雷帕霉素作為一款成熟免疫抑制藥物已經應用于臨床，但其在神經保護方面的用途仍有廣闊的探索和應用前景。