人冠狀動脈內半乳糖凝集素3水平與斑塊穩定性的相關性研究*

彭 進， 王 玉， 張 瓊， 劉江金， 李 竹， 汪家文，夏 冰， 王 杰， 樂翠云， 萬昌武

（貴州醫科大學法醫學院，貴州貴陽550004）

研究顯示，冠心病（coronary heart disease，CHD）的發作及心源性猝死（sudden cardiac death，SCD）的發生與粥樣斑塊結構的穩定性密切相關［1-3］，但影響斑塊穩定性變化的機制仍不明確，有研究指出炎癥反應是影響斑塊穩定性的關鍵因素［4］。

半乳糖凝集素3（galectin-3）屬于凝集素家族的一員［5］，主要由活化的巨噬細胞產生和分泌，在正常組織中呈現低水平表達［6-10］，而在病理狀態下，其表達水平顯著升高［11］。研究顯示，galectin-3能促進動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的形成和發展，并與心肌缺血的嚴重性相關［12-14］。動物實驗也證實了在小鼠的 AS 斑塊中檢測到高表達的 galectin-3［15-16］，提示galectin-3可能作為一個新的炎癥標志物，參與促進CHD的發生和發展。

然而，目前國內外從人體冠狀動脈組織層面直接檢測galectin-3及其相關因子表達水平的研究鮮見報道。本研究采用尸檢案例中的冠脈標本為研究對象，直接檢測冠狀動脈粥樣斑塊內galectin-3的表達水平，探討其表達變化與AS病灶內炎癥反應水平和斑塊穩定性及與SCD的關系。

材料和方法

1 材料收集

選取貴州醫科大學法醫司法鑒定中心2014年1月～2018年12月尸檢案例的冠狀動脈組織標本，并獲得貴州醫科大學倫理審查委員會認可（審批號為201801），根據是否伴有血栓形成、斑塊破裂、斑塊內出血等繼發病變及死亡原因是否為冠心病猝死，分為3組：A1組，有冠狀動脈粥樣硬化但非冠心病猝死者，22例；A2組，冠心病猝死但無上述繼發病變者，20例；A3組，冠心病猝死且伴有上述任一種繼發病變者，24例。選取同期尸檢及組織學檢驗證實冠狀動脈無病變且非心源性疾病死亡者18例作為對照（control）組。

病變組案例納入標準：（1）經解剖的尸體在死亡后48 h內尸檢或死后6 h內冰凍保存；（2）經肉眼及組織學檢驗證實存在AS者，即冠狀動脈管壁內膜增厚、管腔變窄，增厚的冠脈內膜見粥樣斑塊形成，存在或不存在繼發病變形成，合并心肌纖維化和心肌梗死等任一病變；（3）系統尸檢及常規毒物檢測排除暴力致死、中毒死亡及其他疾病致死可能者。對照組案例納入標準：（1）對照組為實驗組同期尸檢經肉眼及組織學檢驗證實無冠狀動脈病變者；（2）死亡原因明確為機械性暴力致死或機械性窒息者。案例排除標準：（1）組織自溶或結構不清；（2）患有風濕性心臟病、心肌病和心肌炎等心臟病者；（3）多發全身炎癥性感染或多器官功能障礙者。

按照納排標準，統一選取無任何病變的冠狀動脈左前降支作為對照組，病變組標本選取肉眼所見冠脈狹窄程度最嚴重處，所選組織采用4%甲醛固定，部分組織置于-80℃冰箱凍存供蛋白測定及mRNA檢測。

2 主要試劑與儀器

鼠抗CD68單克隆抗體（GeneTex）；兔抗galectin-3單克隆抗體和兔抗基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）多克隆抗體（Abcam）；PV-9000兔/鼠超敏二步法免疫組織化學檢測試劑盒（中杉金橋公司）；羊抗鼠/兔IgG（H+L）購自北京索萊寶科技有限公司；RevertAidTM第1鏈cDNA合成試劑盒（Thermo Fisher）。

光學顯微鏡（Olympus）；NanoDrop 2000型超微量紫外分光光度計（Thermo Fisher）；凝膠成像系統（Bio-Rad）；7500 Fast型實時熒光定量PCR儀（Applied Biosystems）。

3 主要方法

3.1 冠狀動脈組織結構的觀察及測量 選取經4%甲醛固定的冠狀動脈組織，以血管橫斷面作常規石蠟包埋，4μm切片后常規HE染色，光鏡觀察并在100倍下拍照，采用Image-Pro Plus 6.0檢測相關指標：（1）冠狀動脈內膜厚度：血管內膜（含病灶）腔緣至外側緣的距離，取最大、最小及隨機共3條測試線平均值，即為內膜厚度；（2）纖維帽厚度：病灶表層纖維帽垂直距離，結果取3次測量平均值；（3）壞死灶厚度：量取病灶中從近腔面緣至近外側緣的最大垂直距離，無壞死灶者計0；（4）血管腔狹窄程度=1-橫斷面上冠狀動脈血管腔的面積/整個血管面積，取3次測量結果平均值，即為血管腔狹窄程度。

3.2 冠狀動脈組織中galectin-3、CD68和MMP-2蛋白表達水平的檢測 采用Western blot法檢測冠狀動脈組織內蛋白表達水平。取-80℃保存的血管組織，充分研磨勻漿，離心后取上清液，采用紫外分光光度計測量蛋白濃度，行12%SDS-PAGE，轉膜至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h后洗膜，根據目標蛋白分子大小，分別加入Ⅰ抗（galectin-3，1∶5 000；CD68和MMP-2，1∶1 000；β-actin，1∶2 000）于4℃孵育過夜，洗膜后加辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的Ⅱ抗（羊抗兔IgG，1∶10 000）室溫孵育1 h，滴加增強化學發光（ECL）液于化學發光成像系統上顯色。以β-actin為內參照，利用ImageJ軟件分析測量條帶灰度值，以3次測量的均值作為測定結果。

3.3 冠狀動脈病灶內galectin-3、CD68和MMP-2的表達與分布觀測 采用免疫組織化學法檢測冠狀動脈病灶內的蛋白表達與分布。經4%甲醛固定后的血管，行常規石蠟包埋，4μm切片，脫蠟，水合。滴加3%H2O2于37℃孵育10 min封閉內源性過氧化物酶，高壓熱修復抗原 3 min，加Ⅰ抗（galectin-3，1∶200；CD68，1∶150；MMP-2，1∶250），陰性對照選用PBS緩沖液，于4℃孵育過夜。次日加入HRP標記Ⅱ抗（羊抗兔IgG，1∶10 000），37℃恒溫孵育50 min后DAB顯色，蘇木素復染，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下計數CD68標記的單核巨噬細胞，于400倍鏡下選取3個視野拍照，Image-Pro Plus 6.0軟件測量平均吸光度（即陽性表達吸光度值/測量總面積）。結果為重復測量3次平均值。

3.4 冠狀動脈組織內galectin-3、CD68和MMP-2 mRNA表達水平檢測 選取-80℃保存的冠脈組織，采用Trizol法提取總RNA，紫外分光光度計測定RNA濃度，經RevertAidTM逆轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA后，采用SYBR?Select Master Mix試劑和相應的引物配制成反應體系，采用7500 Fast實時熒光定量PCR儀測量Ct值，并計算目的基因的轉錄水平。PCR 條件為：50℃ 2 min；95℃ 2 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，40個循環。解離曲線條件為：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。實驗所需的引物遵循引物設計原則，由上海生物工程有限公司合成，序列見表1。

4 統計學處理

采用用SPSS 22.0軟件對所得數據分析處理。計量資料采用均數±標準差（mean±SD）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析；計數資料兩組間比較用卡方檢驗；相關性分析采用Pearson相關系數檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The primer sequences for RT-qPCR

結 果

1 案例基本情況

按照納排標準收集到病變組冠狀動脈標本66例，其中男性33例，女性33例；年齡在30～83歲之間，平均年齡為（53.6±13.7）歲。收集到正常組共計18例，其中男性10例，女性8例，年齡在16～50歲之間，平均年齡（31.9±9.6）歲。比較各組間基線資料，組間性別差異無統計學意義；組間年齡間差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 案例基線資料Table 2.Baseline information for the cases

2 冠狀動脈形態學分析

鏡下可見正常組冠狀動脈內膜壁薄而光滑，內、中、外膜厚度均勻一致；A1組中有纖維帽形成，纖維帽下見數量不等的泡沫細胞，血管腔輕度狹窄；A2組中內膜厚度不均勻增厚，管腔不同程度狹窄，內膜下見典型纖維帽，部分案例纖維帽下見粥樣壞死物，中膜可因斑塊壓迫、平滑肌萎縮等受壓變薄，外膜變化不明顯；A3組血管內膜厚度、壞死灶厚度較A2組增厚，出現典型粥樣壞死灶，壞死灶周邊殘留數量不等的泡沫細胞等炎細胞，壞死灶內可見斑塊內出血、斑塊破裂等繼發病變形成，中膜顯著受壓變薄，由于上述病變的加重，致管腔多呈偏心性狹窄，見圖1。

Figure 1.Microscopic changes of coronary artery（HE staining）.A：control group；B ：atherosclerosis group，A1 group；C ：sudden death of coronary heart disease without secondary lesions，A2 group；D：sudden death of coronary heart disease with grade IV stenosis of vascular lumen，A3 group.圖1 冠狀動脈結構的鏡下變化

圖像分析顯示，病變組冠狀動脈內膜厚度和壞死灶厚度較對照組增高，纖維帽厚度降低，管腔狹窄程度從A1至A3組依次增大（P＜0.05），見表3。

表3 冠狀動脈病灶形態學相關指標Table 3.Comparison of morphological indexes of coronary artery lesions（Mean±SD）

3 冠狀動脈病灶內泡沫細胞計數

對照組血管壁內無泡沫細胞，病變各組病灶內泡沫細胞數量從A1組至A3組逐漸增多，測量值分別為 7.89±2.03、17.58±1.79 和 28.92±2.87，且 A3組泡沫細胞數量顯著高于A2和A1組，A2組高于A1組（P＜0.05）。

4 冠狀動脈組織中galectin-3、CD68和MMP-2蛋白表達

Western blot結果顯示，同正常組比較，病變組冠狀動脈血管組織中galectin-3、CD68和MMP-2蛋白表達增高（P＜0.05）；病變組間蛋白水平比較，A2組蛋白表達高于A1組，A3組蛋白表達高于A2組（P＜0.05），見圖2。

Figure 2.The protein expression of MMP-2，CD68 and galectin-3 in coronary artery.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs A1 group；△P＜0.05 vs A2 group.圖2 冠狀動脈組織內MMP-2、CD68和galectin-3的蛋白表達

5 冠狀動脈粥樣硬化病灶內galectin-3、CD68和MMP-2蛋白表達分布

免疫組織化學結果顯示，正常組冠狀動脈內膜偶見galectin-3的弱陽性表達于內膜下近基底膜處，病變組中galectin-3蛋白在冠狀動脈粥樣硬化病灶周圍及基底部炎癥細胞胞核及胞質中見顆粒狀、點片狀棕黃色著色，且病變組galectin-3蛋白較正常組增高（P＜0.05），其中，A3組中蛋白表達高于A1和A2組，A2組蛋白表達高于A1組（P＜0.05），見圖3、表4。

正常組中未見CD68和MMP-2蛋白的表達，病變組中，CD68蛋白主要表達在病灶肩區及內皮下的泡沫細胞胞質，胞核也有少量表達，呈棕黃色著色，且隨著病程的進展，棕黃色逐漸加深，即CD68蛋白陽性表達逐漸增強（P＜0.05）；MMP-2蛋白主要表達在病灶兩肩區及基底部的細胞外基質，陽性表達較正常組增強（P＜0.05），但A2組與A1組間MMP-2蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05），見圖3、表4。

Figure 3.The expression level of MMP-2，CD68 and galectin-3 in coronary atherosclerotic lesions（IHC staining）.The scale bar=50μm.圖3 AS病灶內MMP-2、CD68和galectin-3蛋白表達分布

表4 AS病灶內CD68、MMP-2和galectin-3的平均吸光度值Table 4.Mean absorbance of CD68，MMP-2 and galectin-3 proteins in coronary artery lesions（Mean±SD）

將病變組內galectin-3、CD68和MMP-2蛋白表達兩兩做相關性分析。結果顯示，病變組內galectin-3與CD68蛋白表達呈顯著正相關（r=0.717，P=0.000），galectin-3與MMP2蛋白表達呈顯著正相關（r=0.695，P=0.000），CD68與MMP-2蛋白表達呈顯著正相關（r=0.794，P=0.000）。

6 冠狀動脈組織中galectin-3、CD68和MMP-2 mRNA的表達水平

RT-qPCR結果顯示，同正常組比較，病變各組MMP-2、CD68和galectin-3 mRNA表達水平升高，且A3組各因子mRNA表達水平高于A1和A2組，A2組又高于A1組（P＜0.05），見圖4。

7 AS病灶內galectin-3、CD68和MMP-2蛋白水平與病灶結構的相關性分析

相關性分析結果顯示，病灶內galectin-3、MMP-2和CD68蛋白水平與病灶厚度和壞死核心厚度呈正相關，與纖維帽厚度呈負相關（P＜0.05），見表5。

8 AS病灶內炎癥反應水平與猝死的關系

Figure 4.The mRNA expression of MMP-2，CD68 and galectin-3 in coronary artery tissues.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs A1 group；△P＜0.05 vs A2 group.圖4 冠狀動脈組織內MMP-2、CD68和galectin-3的mRNA表達水平

表5 病灶內galectin-3、MMP-2和CD68蛋白表達水平與病灶結構參數的相關性分析Table 5.Correlation analysis of protein expression level of galectin-3，MMP2-2 and CD68 and focal structure parameters

將冠心病猝死組與非猝死組中的AS病灶內炎癥細胞總數進行比較，猝死組病灶內炎癥細胞數量高于非猝死組（P＜0.01）；將冠心病猝死組與非猝死組中的血管腔面積分數度進行比較，結果顯示猝死組管腔狹窄程度高于非猝死組（P＜0.01），見表6。

表6 猝死組與非猝死組病灶內炎癥細胞數量及管腔狹窄程度的分析Table 6.Analysis of the inflammatory response and the degree of stenosis in the lesions of sudden cardiac death（SCD）and non-sudden cardiac death（non-SCD）groups

討 論

動脈粥樣硬化被認為是一種發生在血管壁的慢性炎癥反應性疾病［4］。研究表明，多種炎癥細胞及細胞因子參與AS發生發展的病理生理過程［17-20］。單核巨噬細胞在斑塊形成和發生發展中發揮重要作用，在高危因素持續存在的情況下，脂質不斷的堆積于內膜下，刺激包含單核細胞在內的多種炎癥細胞及來源于中膜的平滑肌細胞不斷的積聚于內膜下，吞噬脂質后轉化為泡沫細胞并分泌多種活性物質，使細胞外基質成分發生降解，最終致纖維帽的變薄，促使斑塊不穩定性的發生。

研究表明，galectin-3主要由活化的巨噬細胞產生，參與調節炎癥、纖維化等過程［21-22］。MacKinnon等［15］的動物研究表明，給予ApoE/galectin-3敲除大鼠高脂飲食，大鼠主動脈及其分支中動脈粥樣硬化病變形成減少，斑塊中M2型巨噬細胞的活化也降低；抑制galectin-3表達可減輕小鼠動脈粥樣硬化病變［23］。大量臨床研究也顯示，血漿galectin-3水平與心肌缺血的嚴重程度相關［12-14］，Aksand等［24］的臨床試驗也顯示，冠心病患者的血清galectin-3水平高于健康對照組，同時血清galectin-3水平與冠心病的嚴重程度呈顯著正相關，提示galectin-3是與動脈粥樣硬化斑塊嚴重性和不穩定的異常變化有關的一類生物標記物，但在人體層面直接檢測動脈粥樣硬化斑塊內的galectin-3表達鮮見報道。本研究在人體冠狀動脈內直接檢測galectin-3表達，結果顯示在人體正常冠狀動脈內galectin-3低水平表達于冠脈血管內膜近基底部，進一步證實galectin-3低水平存在于正常的血管組織中［6-10］，而隨著冠狀動脈粥樣硬化病程的進展，galectin-3在病灶內特別是有斑塊破裂、斑塊內出血等繼發病變的病灶內表達明顯增高，在上述研究結果基礎上進一步提示galectin-3可能與AS斑塊的穩定性相關。

CD68作為單核巨噬細胞的標記性分子，其在組織內的表達水平在一定程度上反應了該部位的炎癥程度。動脈粥樣硬化斑塊的不穩定性與包含單核巨噬細胞在內的多種炎癥細胞富集等多種因素直接相關［25］。研究表明，病灶內不穩定性斑塊的炎癥反應程度強，易發生破裂、出血等病變導致斑塊內纖維成分破壞、脂質壞死核心面積增加［26］。本研究直接對冠狀動脈粥樣硬化病灶內單核巨噬源性的泡沫細胞標記并計數，結果顯示病灶內泡沫細胞數量增多，CD68陽性表達增強，提示隨著病程的進展，病灶內炎癥反應逐漸增強，此與本課題組前期研究結果相一致［24］。AS病灶內單核-巨噬細胞系統主要產生MMP-2和MMP-8等［27］。研究顯示，從穩定性斑塊進展到不穩定性斑塊的過程中，血清中MMP-2的表達水平是顯著升高的［28-30］。在急性冠脈綜合征患者的血清中，MMP-2表達明顯高于穩定性心絞痛組［31］。MMP-2在Ca2+和Zn2+幫助下，能降解包括IV型膠原等在內的細胞外基質（extra cellular matrix，ECM），而IV型膠原等是AS斑塊基底膜和纖維帽等的重要組成部分［32-33］。Seifert等［34］的動物實驗也證實，在ApoE-/-小鼠模型中，MMP-2和MMP-9活性在不穩定動脈粥樣硬化斑塊中顯著高于下游更穩定的斑塊表型。以上研究均提示，MMP-2水平的升高是AS穩定性斑塊向不穩定性斑塊發展的重要因素。本研究直接檢測人體冠狀動脈AS斑塊內MMP2表達，結果顯示，在AS病灶內MMP-2表達明顯增高，這進一步驗證了MMP-2在不穩定性斑塊中發揮著關鍵作用并促進斑塊的不穩定。

將病灶內galectin-3與CD68蛋白表達作相關性分析顯示，galectin-3與CD68蛋白表達呈顯著正相關，提示隨著冠狀動脈粥樣硬化病程的進展，病灶內炎癥水平增高，galectin-3的表達也隨之增高；galectin-3的表達與動脈粥樣硬化病灶厚度和壞死核心厚度呈正相關，與纖維帽厚度呈負相關，而MMP-2是反應斑塊穩定性的重要指標，galectin-3與MMP-2蛋白表達呈正相關，提示galectin-3可能通過促進病灶內MMP2的表達，使得細胞外基質分解加強，纖維帽變薄，加速斑塊裂隙，從而促進病變的進展及壞死灶的擴大，使斑塊的穩定性下降，促進其破裂、出血等繼發病變的發生，更甚者導致猝死。

綜上所述，人冠狀動脈粥樣硬化病灶內galectin-3表達水平隨病灶內炎癥程度增強而升高，且病灶內galectin-3水平的改變與病灶結構變化具有相關性，因此，病灶內galectin-3水平變化可能是影響斑塊結構穩定性的環節之一。