PPARγ通過PTEN調控AKT/FAK通路影響高糖條件下腎小管上皮細胞轉分化*

嚴 瑞， 楊雨星， 劉玲伶， 王圓圓， 陳 燁， 郭 兵△

（貴州醫科大學附屬醫院 1腎內科，2內分泌與代謝病科，貴州貴陽550004；3貴州醫科大學貴州省常見慢性疾病發病機制及藥物研究重點實驗室，貴州貴陽550025）

第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN）是人類第10號染色體上發現的一個具有雙重特異性磷酸酶的抑癌基因［1］，它編碼具有脂質磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性的雙重特異性磷酸酶，可通過作用于下游信號通路影響腫瘤的發生［2］。但近年來研究表明，PTEN除與腫瘤相關外，其表達變化在多個組織纖維化的發生中也起到了重要作用［3-4］。我們課題組的前期研究發現，PTEN在糖尿病腎組織及高糖培養的腎小管上皮細胞中是減少的［5］，且PTEN的減少與腎纖維化及細胞自噬有著密切的關系［6-7］。此外，國內外學者也分別在單側輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）、糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）等多種疾病所誘導的腎組織纖維化模型中進行了觀察，對PTEN表達變化與系膜細胞增殖、足細胞損傷的關系進行了研究，并得到了類似的結論［8-11］。由此可見，在糖尿病腎病及其他腎臟疾病中，PTEN表達變化與腎臟病變進展之間有著密切的聯系。但是，在DN進展過程中PTEN的表達減少是受到哪些因素的調控目前并未完全闡明。

在腫瘤中的研究發現，過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）綁定在PTEN的上游，參與對PTEN表達的調控［12］。但是，PPARγ是具有組織及疾病特異性的轉錄因子，在不同的組織及不同疾病中的作用不盡相同，而且糖尿病是與腫瘤從發病機理到病理改變完全不同的兩種疾病。因此在糖尿病腎病發病過程中，PPARγ對PTEN的mRMA及蛋白表達水平有何影響，這種影響對下游的信號通路及腎小管上皮細胞向間充質細胞轉化（即上皮-間充質轉化，epithelial-mesenchymal transition，EMT）將產生何種作用，是否會減輕小管間質纖維化的病變，目前均不清楚，還缺乏系統的研究。

基于此，我們應用高糖培養的腎小管上皮細胞NRK-52E作為實驗對象，應用過表達及敲減PPARγ基因表達的方法來干預NRK-52E細胞，研究PPARγ對PTEN的調節機制，進而對PPARγ如何通過調節PTEN的表達變化來調控蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）/黏著斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）信號通路及影響細胞EMT的機制進行探討。

材料和方法

1 材料與試劑

胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、DMEM正常糖培養基（葡萄糖濃度為5.5 mmol/L）、DMEM高糖培養基（葡萄糖濃度為25.0 mmol/L）和胰蛋白酶（Gibco）；兩步法免疫組化檢測試劑盒（北京中杉金橋公司）；牛血清白蛋白（北京索萊寶）；二甲基亞砜和二硫蘇糖醇（北京鼎國昌盛公司）；Trizol Reagent（Invitrogen）；Western blot細胞裂解液、苯甲基磺酰氟、蛋白酶抑制劑、I抗稀釋液、Triton X-100、BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL顯色劑和抗熒光淬滅封片液（北京碧云天生物研究所）；蛋白酶磷酸酶抑制劑（上海康成生物公司）；0.45μm PVDF膜和Whatman 3 mm濾紙（Millipore）；蛋白質marker、總RNA提取試劑盒、質粒小提試劑盒（TIANprep Mini Plasmid Kit）和2× Taq PCR MasterMix（北京天根公司）；逆轉錄和real-time PCR試劑（廣州銳博生物公司）；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）；iQTMSYBR Green Supermix（Bio-rad）；Lipofectamine 2000轉染試劑盒（上海生物工程公司）；mouse anti-β-actin及生物素標記的羊抗兔和羊抗小鼠IgG（普美生物）；rabbit anti-PPARγ、rabbit antiphospho-AKT（Thr308）和 rabbit anti-phospho-FAK（Tyr397）antibodies（CST）；rabbit anti-PTEN、rabbit anti-E-cadherin、mouse anti-α-SMA、rabbit anti-vimentin、rabbit anti-AKT1和 rabbit anti-FAK antibodies（Abcam）。

2 方法

2.1 細胞培養、轉染及分組 大鼠腎小管上皮細胞株NRK52E（中國科學院昆明細胞庫），在37℃及5%CO2條件下進行培養。MTT法檢測羅格列酮及GW9662對NRK52E細胞活力的影響，并計算最合適的藥物干預濃度。為了構建PPARγ和PTEN過表達及敲減的質粒載體，首先在NCBI基因數據庫查詢PPARγ基因序列（NM_001145367.1）及PTEN基因序列（NM_031606），過表達及shRNA序列由山東維真生物有限公司構建。轉染試劑用的是Lipofectamine 2000轉染試劑盒，按說明書操作。待NRK-52E細胞融合至50%～60%時，轉染相應的質粒，細胞培養48 h。根據不同的干預措施，細胞隨機分為正常糖（normal glucose，NG）組（2%FBS+DMEM+5.5 mmol/L glucose）、高 糖（high glucose，HG）組（2%FBS+DMEM+25 mmol/L glucose）、HG+PPARγ 空 載 體（GFP）組（2%FBS+DMEM+25 mmol/L glucose+GFP）、HG+PPARγ過 表 達（GFP-PPARγ）組（2%FBS+DMEM+25 mmol/L glucose+GFP-PPARγ）、HG+PPARγ shRNA空載體（control shRNA）組（2%FBS+DMEM+25 mmol/L glucose+control shRNA）、HG+PPARγ shRNA組（2%FBS+DMEM+25 mmol/L glucose+PPARγ shRNA）、GW9662組（2%FBS+DMEM+25 mmol/L glucose+GFP+5μmol/L GW9662）、GW9662+過表達PTEN（GFPPTEN）組（2%FBS+DMEM+25 mmol/L glucose+GFPPTEN+5μmol/L GW9662）、羅格列酮組（2%FBS+DMEM+25 mmol/L glucose+control shRNA+5μmol/L羅格列酮）和羅格列酮+PTEN shRNA組（2%FBS+DMEM+25 mmol/L glucose+PTEN shRNA+5μmol/L羅格列酮）。上述各組細胞分別處理至60 mm培養皿中，48 h后收集細胞供各檢測指標的進行（包括細胞免疫熒光、Western blot及RT-qPCR）。

2.2 細胞免疫熒光實驗 細胞爬片，進行相應處理48 h后；棄去培養基后，無菌的細胞用PBS洗凈6孔板；4%多聚甲醛于37℃固定30 min，PBS洗滌3次，每次5 min；10%BSA于37℃孵育30 min；用1%BSA稀釋特異性抗體（PPARγ和PTEN抗體均1∶50稀釋），于4℃孵育過夜；次日，取出6孔板至室溫，放置30 min；將復溫后的6孔板用PBS洗滌3次，每次5 min，滴加1%BSA稀釋的II抗（1∶800），于37℃中避光孵育30 min，隨后PBS洗滌3次，每次5 min；避光滴加即用型DAPI，室溫5 min，隨后PBS洗滌3次，每次5 min；抗熒光淬滅劑封片液封片；倒置熒光顯微鏡下觀察并攝取圖像。蛋白表達部位出現綠色熒光物質為陽性，陰性對照片無熒光物質出現。

2.3 Western blot檢測蛋白水平 各組細胞進行相應處理后，加入細胞裂解液后刮取細胞提取總蛋白，或提取細胞核蛋白和細胞質蛋白。按BCA法試劑盒說明書進行操作進行蛋白定量。根據需要配制濃度不同的分離膠，室溫下靜置約30 min（待其凝固）后灌入5%的濃縮膠，插入梳齒靜置30 min后待用；取適量樣本經SDS-PAGE分離出分子量大小不同的各蛋白（電壓大小及時間據目的蛋白分子量而定）；預冷的轉膜儀中，穩流將蛋白濕轉至PVDF膜上（電流大小及時間據目的蛋白分子量而定）；5%脫脂奶粉室溫孵育1 h；TBST洗滌3次；I抗稀釋液稀釋各特異性抗體［E-cadherin、α-SMA、vimentin、PPARγ、PTEN、AKT1、p-AKT（Thr308）、FAK和p-FAK（Tyr397）抗體均1∶1 000稀釋］，于4℃搖床慢搖孵育過夜；次日，TBST洗膜3次，加入1%脫脂奶粉的TBST稀釋的II抗（1∶7 000），室溫下慢搖孵育1 h；TBST洗滌5 min×3次，TBS洗滌5 min；ECL發光液顯色后曝光；Bio-Rad凝膠成像系統掃描、Quantity One軟件分析后，得到各條帶的灰度值（β-actin作為內參照），算出目標蛋白的相對表達量。重復3次實驗。

3.4 RT-qPCR檢測mRNA表達 各組細胞進行相應處理后，參照Trizol試劑盒說明書抽提細胞總RNA。將RNA進行逆轉錄成cDNA。iQ?SYBR?Green Supermix行PCR擴增，反應體系為20μL［2×SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）10 μL，無RNA酶水6μL，上、下游引物各1μL，cDNA 2μL］。反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性10 s，60℃退火30 s，重復40個循環后，65℃延伸10 min。擴增反應結束后讀取Ct值，以 β-actin/U6為內參照，用 2-ΔΔCt法計算各目的基因相對含量）。重復3次實驗。所用引物由上海生物工程有限公司設計合成。PPARγ的正向引物序列為5′-CGCAGCCTCAGCCAAGAC-3′，反向引物序列為5′-TGGGGAGAGAGGACAGATGG-3′；PTEN的正向引物序列為5′-CAATGTTCAGTGGCGGAACTT-3′，反向引物序列為 5′-GGCAATGGCTGAGGGAACT-3′。

3 統計學處理

采用 SPSS 19.0、GraphPad Prism 5和 Quantity One軟件進行數據統計分析。數據均以均數±標準差（mean±SD）表示。數據符合正態分布，且通過方差齊性檢驗。兩組數據差異的比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 過表達PPARγ后NRK-52E細胞內PPARγ、PTEN及EMT相關指標變化

應用過表達PPARγ質粒轉染NRK-52E細胞株，并在高糖條件下培養，免疫熒光、Western blot及RT-qPCR檢測PPARγ和PTEN及EMT相關因子mRNA及蛋白表達的變化。RT-qPCR結果顯示，過表達PPARγ后，PPARγ的mRNA表達增加，PTEN的mRNA表達也隨之增加（P＜0.05），見圖1。細胞免疫熒光結果顯示，PPAR過表達組的PPARγ及PTEN熒光強度明顯高于空載體對照組，見圖2。Western blot結果顯示，PPARγ過表達組的PPARγ及PTEN蛋白表達水平明顯高于空載體對照組，E-cadherin的表達明顯上調，而vimentin和α-SMA的蛋白水平顯著下調（P＜0.05），見圖3、4。

Figure 1.RT-qPCR was used to detect the mRNA expression of PPARγ and PTEN in each group.Mean±SD.n=3.#P＜0.05 vs GFP group.圖1 RT-qPCR檢測轉染過表達PPARγ質粒后NRK-52E細胞中PPARγ和PTEN的mRNA表達

Figure 2.The protein expression of PPARγ and PTEN in cultured NRK52E cells after transfection with GFP-PPARγ was observed by immunofluorescence staining（×400）.圖2 免疫熒光染色觀察轉染過表達PPARγ質粒后NRK52E細胞中PPARγ和PTEN的蛋白表達

Figure 3.Western blot was used to determine the protein expression of PPARγ and PTEN in cultured NRK52E cells after transfection with GFP-PPARγ.Mean±SD.n=3.#P＜0.05 vs GFP group.圖3 Western blot檢測轉染過表達PPARγ質粒后NRK52E細胞中PPARγ和PTEN蛋白表達的變化

Figure 4.Western blot was used to determine the protein expression of E-cadherin，vimentin and α-SMA in cultured NRK52E cells after transfection with GFP-PPARγ.Mean±SD.n=3.#P＜0.05 vs GFP group.圖4 Western blot檢測轉染過表達PPARγ質粒后NRK52E細胞中E-cadherin、vimentin和α-SMA的蛋白表達

2 敲減PPARγ后，NRK-52E細胞PPARγ、PTEN及EMT相關指標的變化

應用PPARγ shRNA質粒轉染NRK-52E細胞株，并在高糖條件下培養，應用免疫熒光、Western blot及RT-qPCR檢測PPARγ和PTEN及EMT相關因子mRNA及蛋白表達的變化。RT-qPCR結果顯示，敲減PPARγ后，PPARγ的mRNA表達顯著降低，PTEN的mRNA表達也隨之減少（P＜0.05），見圖5。細胞免疫熒光結果顯示，PPARγ敲減組的PPARγ及PTEN熒光強度明顯弱于空載對照組，見圖6。Western blot結果顯示，PPARγ敲減組的PPARγ及PTEN蛋白表達水平明顯低于空載對照組，E-cadherin的表達明顯下調，而vimentin和α-SMA蛋白表達顯著升高（P＜0.05），見圖7、8。

3 PPARγ抑制劑GW9662處理并過表達PTEN對AKT、p-AKT、FAK和p-FAK蛋白水平的影響

Figure 6.The protein expression of PPARγ and PTEN in cultured NRK52E cells after transfection with PPARγ shRNA was observed by immunofluorescence staining（×400）.圖6 免疫熒光染色觀察轉染PPARγ shRNA質粒后NRK52E細胞中PPARγ和PTEN的蛋白表達

Figure 5.RT-qPCR was used to detect the mRNA expression of PPARγ and PTEN in the NRK52E cells.Mean±SD.n=3.#P＜0.05 vs control shRNA group.圖5RT-qPCR檢測轉染PPARγ shRNA質粒后NRK52E細胞中PPARγ和PTEN mRNA表達的變化

與高糖組相比，GW9662組PTEN的蛋白水平降低，而p-AKT（Thr308）、FAK及p-FAK（Tyr397）的蛋白水平均顯著升高（P＜0.05）；與GW9662組相比，GW9662+過表達PTEN組PTEN的蛋白水平明顯增高，并伴隨p-AKT（Thr308）、FAK及p-FAK（Tyr397）的蛋白水平降低（P＜0.05）；而AKT在各組間的差異無統計學顯著性，見圖9。

Figure 7.Western blot was used to determine the protein expression of PPARγ and PTEN in cultured NRK52E cells after transfection with PPARγ shRNA.Mean±SD.n=3.#P＜0.05 vs control shRNA group.圖7 Western blot檢測轉染PPARγ shRNA質粒后NRK52E細胞中PPARγ和PTEN蛋白表達的變化

Figure 8.Western blot was used to determine the protein expression of E-cadherin，vimentin and α-SMA in cultured NRK52E cells after transfection with PPARγ shRNA.Mean±SD.n=3.#P＜0.05 vs control shRNA group.圖8 Western blot檢測轉染PPARγ shRNA質粒后NRK52E細胞中E-cadherin、vimentin和α-SMA蛋白表達的變化

Figure 9.Western blot was used to determine the protein levels of AKT，p-AKT，FAK and p-FAK in the NRK-52E cells with GW9662 treatment and over-expression of PTEN.Mean±SD.n=3.#P＜0.05 vs HG group；*P＜0.05 vs GW9662 group.圖9Western blot檢測GW9662處理并過表達PTEN對AKT、p-AKT、FAK和p-FAK蛋白水平的影響

4 PPARγ激動劑羅格列酮處理并敲減PTEN對AKT、p-AKT、FAK和p-FAK蛋白水平的影響

與高糖組相比，羅格列酮組PTEN的蛋白水平增高，而p-AKT（Thr308）、FAK和p-FAK（Tyr397）的蛋白水平降低（P＜0.05）；與羅格列酮組相比，羅格列酮+PTEN shRNA組PTEN的蛋白水平降低，相應的p-AKT（Thr308）、FAK和p-FAK（Tyr397）的蛋白水平增高（P＜0.05）；AKT在各組間的差異無統計學顯著性，見圖10。

討 論

本課題組前期研究顯示，PTEN在糖尿病條件下的表達是減少的，且PTEN通過調控細胞自噬而參與調節腎小管上皮細胞的EMT［5-7］。但是，是何種原因導致了PTEN的表達減少目前并未完全闡明，這需要從對PTEN具有調控作用的信號分子來進行探討。Bonofiglio等［12］在腫瘤中研究了PTEN的啟動子及其轉錄因子，發現PPARγ綁定在PTEN的上游，與其上游的PPRE1和PPRE2兩個反應元件結合，參與對PTEN表達的調控。但也有研究提示，PPARγ在惡性腫瘤中的表達具有疾病和組織特異性，不同病變組織中PPARγ的作用可能不同［13-15］。同樣，在DN發生發展過程中，腎小管上皮細胞PPARγ表達的變化及其是否對PTEN表達具有調控作用目前并不清楚，需要研究明確。

Figure 10.Western blot was used to determine the protein levels of AKT，p-AKT，FAK and p-FAK in the NRK-52E cells with rosiglitazone treatment and knockdown of PTEN.Mean±SD.n=3.#P＜0.05 vs HG group；*P＜0.05 vs rosiglitazone group.圖10 Western blot檢測羅格列酮處理并敲減PTEN對AKT、p-AKT、FAK和p-FAK蛋白水平的影響

有學者在對結腸癌、肝癌細胞和非小細胞肺癌細胞株等研究中發現羅格列酮可通過上調PTEN蛋白和mRNA的表達，阻斷PI3K/AKT信號通路，抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡［16-18］。GW9662是PPARγ阻斷劑，目前有關GW9662與腎間質纖維化的研究報道較少。Liu等［19］發現，GW9662能顯著上調體外培養的多囊腎細胞TGF-β1表達，誘導膠原和FN聚集。Kusunoki等［20］報道，GW9662通過增加 UUO小鼠腎臟組織TGF-β1的表達而顯著加重腎間質的病變和纖維化程度［20］。

但是無論是PPARγ的激動劑還是抑制劑，其本身并不影響PPARγ的表達，因此，并未充分證明PPARγ表達變化對PTEN會產生何種影響。另外有學者研究發現，PPARγ激動劑可以不依賴于PPARγ而產生相應作用［21］。因此，我們該研究采用過表達和敲減PPARγ基因的方法，研究在PPARγ表達變化時將會對PTEN產生何種影響。研究結果顯示，過表達PPARγ后，PTEN蛋白及mRNA升高，反應細胞EMT的指標E-cadherin的表達明顯上調，而vimentin和α-SMA蛋白表達顯著下調；敲減PPARγ后，PTEN的蛋白及mRNA表達明顯減少，反應細胞EMT的指標E-cadherin的表達明顯下調，而vimentin和α-SMA蛋白表達顯著升高，該結果證實了在高糖培養的腎小管上皮細胞中，PPARγ的表達變化能調控PTEN的表達，且對蛋白及mRNA表達均有影響，說明PPARγ是從轉錄水平影響了PTEN的表達。因此推測，當PPARγ表達水平增高時，可能通過其作為轉錄因子的作用，促進PTEN的轉錄，并通過對PTEN的調控影響了細胞的EMT。

PPARγ的調節作是多方面的，PTEN只是其中之一。既往的研究也顯示，PPARγ對AKT通路和FAK通路存在一定的調節作用。但這種調節是PPARγ的直接調節，還是通過PTEN來實現的調節，目前并未見相關報道。因此本研究為了進一步明確該問題，設計了在過表達及敲減PTEN的情況下，分別給予PPARγ的抑制劑及激動劑的方法，來進一步觀察PPARγ對下游通路的調節是否是通過PTEN來實現的。結果顯示，與高糖組相比，GW9662組p-AKT（Thr308）、FAK及p-FAK（Tyr397）的蛋白水平增高；GW9662+過表達PTEN組與GW9662組相比，p-AKT（Thr308）、FAK及p-FAK（Tyr397）的蛋白水平降低；而給予羅格列酮和敲減PTEN后其趨勢則相反。這一結果說明，通過干預PTEN的表達，影響了PPARγ對AKT及FAK的調節效果，也即說明PPARγ對AKT及FAK通路的調節作用主要是通過PTEN實現的。

本研究初步證實了PPARγ對PTEN/AKT/FAK的調控作用，但涉及該信號通路的具體調控過程及各信號蛋白之間的相互作用，還需要我們進行進一步驗證和探討。