miR-92b-5p通過靶向HMGB1減輕糖尿病腎病大鼠腎損傷和炎癥反應*

龐 欣， 王曉蒙， 龐欣欣， 張建偉， 王學敏

（河南中醫藥大學第二附屬醫院腎病科，河南鄭州450002）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常見的臨床微血管并發癥之一，是慢性腎臟病的常見病因，占終末期腎臟病的45%［1］。DN的病理特征涉及腎臟功能和結構的各種變化，包括巨噬細胞浸潤、腎小球和腎小管肥大、腎小球基底膜增厚、細胞外基質積聚等［2］。此外，持續的高糖環境能夠誘發炎癥反應的發生，而炎癥加劇能夠直接破壞腎臟結構，這與DN的發展密切相關［3］。盡管在藥物發現和開發方面取得了巨大進步，但仍然有必要深入了解DN的病因和發現新的生物標志物和治療靶標。

微小RNA（microRNA，miRNA，miR）在廣泛的生理和病理過程中的關鍵功能，包括細胞存活、增殖、分化、凋亡以及免疫反應［4］。已證明miRNA的失調與DN病理事件密切相關，說明miRNA有作為DN診斷性生物標志物和治療靶標的可能性。例如，miR-203低表達通過增加Toll樣受體4促進DN［5］。已有研究表明，DN小鼠腎細胞中miR-92b表達水平降低，且過表達miR-92b可減輕腎纖維化［6］。但miR-92b對DN大鼠的作用和機制尚不清楚。于是，本研究將主要探討miR-92b過表達對DN大鼠的作用及其機制。

材料和方法

1 材料

1.1 動物及細胞 SPF級的雄性SD大鼠90只，6周齡，體重（200±20）g，購自四川夏派森醫藥科技有限公司，許可證號為SYXK（川）2017-203。實驗動物飼養室溫度控制在（21±2）℃，濕度控制在（55±2）%，光照/黑暗周期為12 h。大鼠在實驗前均予普通飼料適應性喂養1周。大鼠腎細胞NRK-52E購自上海奧陸生物科技有限公司。

1.2 試劑 鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）購自上海艾研生物科技有限公司；檸檬酸鹽緩沖液購自北京諾博菜德科技有限公司；慢病毒陰性對照（lentiviral negative control，LV-NC）、LV-miR-92b、高遷移率族蛋白B1慢病毒（LV-high mobility group protein B1，LV-HMGB1）和引物均購自上海生工生物工程有限公司；RIPA裂解緩沖液和BCA試劑盒購自上海易色醫療科技有限公司；HMGB1抗體購自Abcam；白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒購自上海聯碩生物刻科技有限公司。

1.3 儀器 HCC400全自動生化分析儀購自山東國康生物科技有限公司；Multiskan GO型全自動酶標儀購自Thermo；FluorChem HD2凝膠成像系統購自Proteinsimple；FACSCalibur流式細胞儀購自BD。

2 方法

2.1 模型的構建及處理 將實驗大鼠分為對照（control）組、模型（DN）組、LV-NC組、miR-92b過表達（LV-miR-92b）組、HMGB1過表達（LV-HMGB1）組及miR-92b和HMGB1均過表達（miR-92b+HMGB1）組，每組15只。禁食12 h后，DN組大鼠腹腔注射60 mg/kg STZ（溶于0.1 mol/L檸檬酸緩沖液，pH 4.5）［7］；control組大鼠腹腔注射等體積檸檬酸鹽緩沖液。注射STZ 72 h后測量血糖水平，血糖水平高于16.7 mmol/L即認為造模成功。各處理組大鼠分別或聯合靜脈注射100μL LV-NC、LV-miR-92b和LV-HMGB1（1×1011U/L），每周2次［8］。8周后將大鼠處死，并收集腎臟組織進行進一步分析。

2.2 全自動生化分析儀檢測尿蛋白、血糖、血尿素氮和血清肌酐 實驗結束最后一天，使用代謝籠收集尿液樣本，采用全自動生化分析儀測定尿蛋白濃度；從腹主動脈中采集血樣，離心，留取血清，用全自動生化分析儀檢測血糖、血尿素氮和血清肌酐含量。

2.3 RT-qPCR檢測miR-92b-5p和HMGB1 mRNA表達 將腎組織剪碎并研磨，采用Trizol裂解試劑提取總RNA，采用cDNA逆轉錄試劑盒合成cDNA。RT-qPCR采用SYBR-Green PCR試劑盒說明書操作進行。miR-92b-5p（用U6標準化）的循環條件為：94℃ 20 s，60℃ 35 s，40個循環。HMGB1（用β-actin標準化）的循環條件為：94℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環。miR-92b-5p的上游引物序列為5′-AGGGACGGGACGCGGTGCAGTG-3′，下 游 引 物 序 列 為 5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；U6的上游引物序列為 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，下游引物序列為5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'；HMGB1的上游引物序列為 5′-TCATCTGCTGCAGTGTTGTT-3′，下游引物序列為5′-CTCAGAGAGGTGGAAGA-3′；β-actin的上游引物序列為 5′-AACCCTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3′，下游引物序列為5′-TCATGAGGTAGTCTGTCAGGT-3′。每個樣品進行3次重復分析。使用2-ΔΔCt方法計算。

2.4 雙螢光素酶報告基因實驗驗證靶向關系 將1μg螢火蟲螢光素酶報告基因構建體pGL3-HMGB1-WT（HMGB1野生型）或pGL3-HMGB1-MUT（HMGB1突變型），以及miR-92b-5p mimic或mimic-NC和pRL-CMV海腎螢光素酶報告質粒轉染大鼠腎細胞NRK-52E。轉染48 h后，細胞裂解15 min，雙熒光素酶檢測系統測量螢光素酶的相對活性，用螢火蟲螢光素酶活性和海腎螢光素酶活性比值表示螢光素酶的相對活性。

2.5 Western blot檢測腎組織中HMGB1表達 用RIPA裂解緩沖液從腎組織中提取總蛋白，并用BCA試劑盒測定蛋白濃度；總蛋白經SDS-PAGE分離后轉移至PVDF膜上，加入對應Ⅰ抗（均1∶1 000稀釋），在4℃下過夜；用TBST沖洗后，在37℃條件下，加入Ⅱ抗（1∶2 000稀釋）孵育60 min；用TBST沖洗后，加入ECL曝光。以β-actin為內參照，使用Quantity One軟件分析目標蛋白質的相對表達水平。

2.6 HE染色觀察腎損傷 將腎臟用4%多聚甲醛溶液固定，常規脫水并制成石蠟切片；然后經脫蠟、蘇木精液染色、1%鹽酸乙醇分化、0.6%氨水返藍、0.5%伊紅液染色后，再常規脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，在400倍顯微鏡觀察腎損傷情況。

2.7 流式細胞術檢測腎細胞凋亡 將腎組織剪碎，用胰酶消化細胞，4 000×g離心，按1×109/L的密度重懸。細胞懸液中加入5μL annexin V-FITC和5μL PI，在黑暗的房間里孵化15 min，然后用流式細胞儀分析細胞凋亡情況。細胞凋亡率（%）=（早期凋亡細胞+晚期凋亡細胞）/全部細胞×100%。

2.8 ELISA檢測腎組織中IL-6、IL-1β和TNF-α的水平 將腎組織在冰上研磨，并制成10%組織勻漿，按照IL-6、IL-1β和TNF-α ELISA試劑盒說明檢測腎組織中IL-6、IL-1β和TNF-α的水平。

3 統計學處理

所有統計數據采用SPSS 21.0處理，使用Graph-Pad Prism 6.0制圖。實驗數據以均數±標準差（mean±SD）表示。數據經Shapiro-Wilk檢驗均呈正態分布。兩組間均數比較采用t檢驗；多組間均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 DN大鼠腎組織中miR-92b-5p低表達，HMGB1 mRNA高表達

與control組相比，DN組大鼠血糖水平顯著升高（P＜0.01），腎組織中miR-92b-5p表達顯著下調（P＜0.01），而HMGB1 mRNA表達顯著上調（P＜0.01），見圖1。

Figure 1.The blood glucose levels in diabetic nephropathy（DN）rats and the expression levels of miR-92b-5p and HMGB1 mRNA in kidney tissues.A：blood glucose level was detected by automatic biochemical analyzer；B：miR-92b-5p expression in kidney was detected by RT-qPCR；C：mRNA expression of HMGB1 in kidney was detected by RT-qPCR.Mean±SD.n=15.**P＜0.01 vs control group.圖1DN大鼠血糖水平及腎組織中miR-92b-5p和HMGB1 mRNA表達

2miR-92b-5p靶向下調HMGB1

根據TargetScan數據庫的預測，miR-92b-5p與HMGB1的3'端非翻譯區（3'-untranslated region，3'-UTR）存在結合位點（圖2A）。雙螢光素酶報告基因實驗結果顯示，miR-92b-5p高表達顯著抑制了含有野生型HMGB1質粒的螢光素酶活性（P＜0.01），但對突變型HMGB1質粒的螢光素酶活性無影響，見圖2B。與DN組相比，LV-NC組大鼠腎組織中miR-92b-5p和HMGB1蛋白表達差異無統計學意義，LV-miR-92b組大鼠腎組織中miR-92b-5p表達顯著上調，HMGB1蛋白表達顯著下調（P＜0.01），LVHMGB1組大鼠腎組織中miR-92b-5p表達顯著下調，HMGB1蛋白表達顯著上調（P＜0.01）；與LV-miR-92b組相比，miR-92b+HMGB1組大鼠腎組織中miR-92b-5p表達顯著下調，HMGB1蛋白表達顯著上調（P＜0.01），見圖2C、D。

Figure 2.miR-92b-5p targeted HMGB1 and down-regulated its expression.A：the binding site between miR-92b-5p and HMGB1 was predicted by TargetScan；B：the targeting relationship was verified by dual-luciferase reporter assay；C：miR-92b-5p expression was detected by RT-qPCR；D：the protein expression level of HMGB1 was detected by Western blot.Mean±SD.n=15.△△P＜0.01 vs HMGB1 MUT group；**P＜0.01 vs DN group；##P＜0.01 vs LV-miR-92b group.圖2 miR-92b-5p靶向下調HMGB1

3 miR-92b-5p通過靶向HMGB1改善DN模型大鼠的生化改變

與control組大鼠相比，DN組大鼠24 h尿蛋白、血糖、血清肌酐和血尿素氮水平均顯著升高（P＜0.01）；與DN組相比，LV-NC組大鼠24 h尿蛋白、血糖、血清肌酐和血尿素氮水平均無顯著變化，LV-miR-92b組大鼠24 h尿蛋白、血糖、血清肌酐和血尿素氮水平均顯著降低（P＜0.01），LV-HMGB1組大鼠24 h尿蛋白、血糖、血清肌酐和血尿素氮水平均顯著升高（P＜0.01）；與 LV-miR-92b組相比，miR-92b+HMGB1組大鼠24 h尿蛋白、血糖、血清肌酐和血尿素氮水平均顯著升高（P＜0.01），見圖3。

Figure 3.The 24-hour urine protein，blood glucose，serum creatinine and blood urea nitrogen levels in rats were by automatic biochemical analyzer.Mean±SD.n=15.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs DN group；&&P＜0.01 vs LV-miR-92b group.圖3 大鼠24 h尿蛋白、血糖、血清肌酐和血尿素氮水平

4 miR-92b-5p通過靶向HMGB1減輕DN模型大鼠腎損傷

在control組小鼠中，腎小球形狀規則，細胞排列整齊、輪廓清晰，未觀察到增生性腎小球基底膜及炎性細胞的浸潤；在DN組可見腎小球系膜和基底膜小管增生、腫脹并伴有大量炎性細胞的浸潤；與DN組相比，LV-NC組大鼠腎組織無變化，LV-miR-92b組大鼠腎小球系膜和基底膜小管增生、腫脹及炎性細胞的浸潤程度顯著減輕，LV-HMGB1組大鼠腎小球系膜和基底膜小管增生、腫脹及炎性細胞的浸潤程度顯著加重；與LV-miR-92b組相比，miR-92b+HMGB1組大鼠腎小球系膜和基底膜小管增生、腫脹及炎性細胞的浸潤程度顯著加重，見圖4。

5 miR-92b-5p通過靶向HMGB1減輕DN模型大鼠腎組織細胞凋亡

與control組大鼠相比，DN組大鼠腎組織細胞凋亡率升高（P＜0.01）；與DN組相比，LV-NC組大鼠腎組織細胞凋亡率無顯著差異，LV-miR-92b組大鼠腎組織細胞凋亡率顯著降低（P＜0.01），LV-HMGB1組大鼠腎組織細胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與LV-miR-92b組相比，miR-92b+HMGB1組大鼠腎組織細胞凋亡率顯著升高（P＜0.01），見圖5。

Figure 4.Renal tissue damage observed by HE staining.The scale bar=50μm.圖4 HE染色觀察腎組織損傷

Figure 5.Apoptosis rate was detected by flow cytometry.Mean±SD.n=15.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs group；&&P＜0.01 vs LV-miR-92b group.圖5 流式細胞術檢測細胞凋亡率

6 miR-92b-5p通過靶向HMGB1減輕DN模型大鼠腎炎癥反應

與control組大鼠相比，DN組大鼠腎組織中IL-6、IL-1β和TNF-α含量均增加（P＜0.01）；與DN組相比，LV-NC組大鼠腎組織中IL-6、IL-1β和TNF-α含量均無顯著差異，LV-miR-92b組大鼠腎組織中IL-6、IL-1β和TNF-α含量均顯著減少（P＜0.01），LVHMGB1組大鼠腎組織中IL-6、IL-1β和TNF-α含量均顯著增加（P＜0.01）；與 LV-miR-92b組相比，miR-92b+HMGB1組大鼠腎組織中IL-6、IL-1β和TNF-α含量均顯著增加（P＜0.01），見圖6。

討 論

DN是糖尿病的致命性微血管并發癥之一，具有多種致病因素，但治療選擇有限［9］，因此，探討新的DN診斷性生物標志物和治療靶標具有至關重要的意義。STZ誘導的DN大鼠模型已被廣泛用于研究DN的發病機理。DN的主要致病因素包括葡萄糖和脂質代謝紊亂、炎癥因子的異常表達及腎細胞異常凋亡等。miRNA的異常與多種疾病的發生有關。已有報道表明miR-92b在腎臟病理生理中具有重要作用，如miR-92b通過靶向調控水通道蛋白2來減輕阿霉素腎病患者的腎水腫［10］。因此，本項工作選取STZ誘導的DN大鼠模型，來研究miR-92b對DN腎損傷、腎細胞凋亡及炎癥反應作用和機制。

Figure 6.The content of IL-6，IL-1β and TNF-α in rat kidney tissues.Mean±SD.n=15.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs DN group；&&P＜0.01 vs LV-miR-92b group.圖6 大鼠腎組織中IL-6、IL-1β和TNF-α含量

與文獻報道［6］一致，本研究證實了miR-92b在STZ誘導的DN大鼠腎臟組織中表達下調，故miR-92b過表達有望抑制DN的發展。已有眾多研究證明，STZ誘導的DN大鼠的血糖、血清肌酐和血尿氮水平顯著上調，腎組織細胞凋亡加重，腎組織中IL-6、IL-1β和TNF-α含量顯著增多，這與本研究的結果相一致［11-12］。本研究結果表明，miR-92b過表達可降低DN大鼠24 h尿蛋白、血糖、血清肌酐和尿素氮水平，減輕腎小球系膜和基底膜小管增生、腫脹及炎性細胞的浸潤程度，降低腎組織細胞凋亡率，減少腎組織中IL-6、IL-1β和TNF-α含量，這些結果證實了miR-92b過表達減輕DN腎損傷及炎癥反應，抑制了DN的體內進展。

為了進一步研究miR-92b參與DN進程的分子機制，我們尋找了miR-92b的潛在靶標。生物信息學和螢光素酶報告基因實驗表明，HMGB1是miR-92b的潛在靶標。本研究表明HMGB1在DN大鼠中高表達，這與Chen等［13］的研究結果相一致。HMGB1屬于細胞核和細胞質中進化最保守的蛋白，是高遷移率族核蛋白家族的成員之一，以其雙重DNA結合結構域而聞名［14］。在正常情況下，HMGB1參與包括轉錄、DNA修復、分化和發育等各種生物過程。但從壞死或激活的細胞釋放時，它是一種有效的促炎細胞介質［15］。研究表明，包括巨噬細胞和單核細胞在內的先天免疫細胞會主動分泌HMGB1［16］。已經證明HMGB1不僅誘導多種細胞因子，例如IL-1β、IL-6和IL-8，而且還刺激壞死性炎癥［17］。糖基化終末產物受體是激活HMGB1的主要途徑［18］。已有研究表明，高血糖誘導的HMGB1釋放會導致腎損傷，從而導致DN期間腎小管間質發炎［19］。本研究表明，過表達HMGB1可升高DN大鼠24 h尿蛋白、血糖、血清肌酐和血尿素氮水平，加重腎小球系膜和基底膜小管增生、腫脹及炎性細胞的浸潤程度，升高腎組織細胞凋亡率，增加腎組織中IL-6、IL-1β和TNF-α含量；HMGB1過表達逆轉了miR-92b對DN大鼠24 h尿蛋白、血糖、血清肌酐和血尿素氮水平的降低，腎小球系膜和基底膜小管增生、腫脹及炎癥細胞浸潤程度的減輕，腎組織細胞凋亡率的降低及腎組織中IL-6、IL-1β和TNF-α含量的減少。已有研究表明阻斷HMGB1可減輕小鼠DN［20］。因此，本研究結果提示miR-92b-5p通過靶向下調HMGB1來減輕DN大鼠腎損傷和炎癥反應。

綜上所述，miR-92b-5p通過靶向下調HMGB1來減輕DN腎損傷和炎癥反應，但miR-92b-5p對DN腎損傷和炎癥反應作用的分子機制及信號通路還需深入研究。