MG63細胞對載辛伐他汀納米膠束攝取的高效液相色譜法測定*

牛 茂，馮先玲，許有誠

MG63細胞對載辛伐他汀納米膠束攝取的高效液相色譜法測定*

牛 茂1，馮先玲2，許有誠1

（1. 深圳職業(yè)技術(shù)學院 醫(yī)學技術(shù)與護理學院，廣東 深圳 518055；2. 深圳大學 醫(yī)學部，廣東 深圳 518060）

本實驗旨在應(yīng)用高效液相色譜（HPLC）法定量檢測人成骨樣細胞—MG63細胞對載辛伐他汀納米膠束（SVNs）的攝取情況．首先，建立檢測SVNs中SV含量的HPLC法，確定色譜條件，并對該方法的專屬性與準確性進行評價．其次，將SVNs與辛伐他汀（SV）干預(yù)細胞，在加藥后的不同時間終止實驗，反復(fù)凍融破碎細胞，提取胞內(nèi)藥物并用HPLC法對其進行檢測．結(jié)果顯示，當流動相比例為30：70（V/V）時，定量檢測SVNs中SV含量的標準曲線擬合方程為=33782-1424.5（2=0.9999），線性范圍為0.2~3.2 μg/mL．該方法專屬性與準確性均較高，并成功檢測出了被MG63細胞攝取到胞內(nèi)的藥物含量．同時，在加藥早期，SVNs與SV相比，SVNs被MG63細胞攝取的速度較慢，但胞內(nèi)藥物含量顯著高于SV，SVNs與SV被MG63細胞攝取存在顯著差異．

辛伐他?。患{米膠束；高效液相色譜法；成骨細胞；細胞攝取

辛伐他?。╯imvastatin，SV）可促進骨缺損區(qū)域新骨形成[1]，在增加口腔種植修復(fù)患者頜骨骨量及縮短口腔種植體與頜骨發(fā)生骨結(jié)合時間方面有較大的應(yīng)用前景．但SV作為脂溶性藥物，難溶于水，骨生物利用度極低，且大量使用時存在潛在的副作用[2,3]，從而嚴重限制了其在頜骨成骨領(lǐng)域的應(yīng)用．本課題組在前期通過應(yīng)用納米膠束包載SV，將其改造為載辛伐他汀納米膠束（simvastatin-loaded nanomicelles，SVNs）后，顯著提高了SV的體內(nèi)、外成骨生物學效能[4,5]，但關(guān)于SVNs顯著提高SV促成骨效能的機制目前知之較少．

細胞對藥物攝取的方式對藥效發(fā)揮具有重要的影響．脂溶性的小分子藥物如SV大多以被動擴散的方式，沿著藥物濃度梯度進入細胞．而載藥納米膠束如SVNs呈水溶性，主要以網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞作用進入細胞[6-8]．因此，SVNs和SV被成骨細胞以不同方式攝取是SVNs顯著提高SV促成骨效能的可能機制之一．

目前，載藥納米膠束的細胞攝取情況常采用熒光探針代替藥物進行間接、定性或半定量的研究[9-11]．這種方法常選擇熒光探針—6-香豆素作為如SV等脂溶性藥物的模型，然后，用納米膠束包載熒光探針，在激光共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscopy，CLSM）或流式細胞儀（Flow cytometer）下觀察不同時相細胞內(nèi)的熒光強度，并用軟件對熒光強度進行計算，進而對該種納米藥物的攝取情況進行定性或半定量評價．這種采用熒光探針代替實際藥物對合成的納米藥物細胞攝取情況測定的方法是否真實可靠是值得商榷的．

高效液相色譜（high-performance Liquid chromatography，HPLC）法憑借其高精度、高靈敏度特性可實現(xiàn)對細胞內(nèi)藥物直接進行定量研究．本研究應(yīng)用HPLC法實現(xiàn)了對MG63細胞攝取入細胞內(nèi)的SVNs中SV含量進行定量檢測，為后續(xù)進一步研究SVNs被成骨細胞攝取的方式及機制打下基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 SVNs的合成及表征

本實驗中使用的SVNs由課題組前期應(yīng)用透析法合成[5]．納米膠束材料為甲氧基聚乙二醇-聚乳酸二嵌段共聚物（methoxy polyethy-lene glycoL-Polylactic acid，mPEG-PLA）（Mn=5000- 3000）．合成的SVNs外型呈球形，粒徑為（26.62±6.02）nm．

1.2 高效液相色譜法檢測SVNs中SV含量的方法建立

1.2.1 色譜條件

高效液相色譜儀為島津-20AD HPLC系統(tǒng)；色譜柱為KromasiL C18（250×4.6 mm）；通過參閱文獻，分別選擇0.1%磷酸水溶液（色譜純）和乙腈溶液（色譜純）作為流動相A（水相）和流動相B（有機相），兩者比例為35:65和30:70（V/V），通過后續(xù)實驗擇優(yōu)選擇；進樣量為10 μL；流速為1 mL/min；檢測波長為238 nm；柱溫為30 ℃．

1.2.2 繪制SV標準曲線

用適量乙腈溶解SV標準品配制成濃度為200μg/mL的SV溶液．首先，分別在流動相比例為35:65和30:70（V/V）時，進樣200 μg/mL SV溶液10 μL，確定SV主成分峰的保留時間．其次，分別吸取10、20、40、80 和160 μL溶液用乙腈稀釋到10 mL，制成0.2、0.4、0.8、1.6和3.2 μg/mL系列梯度濃度SV溶液，在上述色譜條件下繪制SV的標準曲線．

1.2.3 確定方法專屬性

分別取SV溶液、SVNs溶液、空白納米粒溶液和空白溶液（乙腈溶液）分別進樣10 μL，得色譜圖后觀察空白納米粒溶液和空白溶液是否會干擾SV和SVNs的檢測，以確定其方法專屬性的優(yōu)劣．

1.2.4 方法的精密度和回收率

選取0.2、0.8和3.2 μg/mL3個濃度連續(xù)3 d測定上述方法的回收率，進而測定該方法的日內(nèi)和日間精密度．

1.3 MG63細胞對SVNs攝取的HPLC法定量檢測

本實驗分為兩組，包括實驗組—載SV納米膠束組（simvastatin-loaded nanomicelle group，SVNG）和對照組—SV組（free simvastatin group，SVG）．

將MG63細胞按5×105/孔接種于6孔板上，每孔加完全培養(yǎng)基2 mL，在37 ℃和5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后吸除完全培養(yǎng)基，用預(yù)熱至37 ℃的PBS溶液潤洗3次，每孔加入2 mL無血清培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱中孵育60 min，按實驗分組加入已預(yù)熱到37 ℃的相應(yīng)藥物（藥物用無血清培養(yǎng)基配制），SVNG和SVG中SV的濃度為2 μg/mL，分別在5、10、15、30、60、120、180和240 min終止實驗，傾去藥物并用預(yù)冷的PBS溶液快速潤洗4次后置于-80 ℃冰箱，反復(fù)凍融細胞3次使MG63細胞破裂釋放出攝入胞內(nèi)的SVNs和SV，每孔加入1 mL乙腈溶液提取SV，超聲3 min，10000 r/min離心5 min，取上清液，0.22 μm針孔濾膜過濾入進樣瓶，采用HPLC法定量測定SVNs和SV的攝入量．

2 結(jié)果與討論

2.1 SVNs中SV含量進行定量檢測

用HPLC法對SV進行檢測時常采用梯度洗脫和等度洗脫方式．一般梯度洗脫用于復(fù)雜試樣的檢測分析，操作較繁瑣[12]．本實驗使用的SV標準品純度在99%以上，更適用于等度洗脫方式對其進行檢測．在采用HPLC法檢測SV時，流動相A與B的比例是需要根據(jù)實驗條件進行調(diào)整的，兩者的比例一般在30:60-10:90之間[13-15]．

本實驗將流動相A與B的比例設(shè)定為35:65和30:70．實驗結(jié)果顯示，當流動相A與流動相B的比例為35:65時，SV主成分峰的保留時間為21.603 min（圖1A），在0.2~3.2 μg/mL范圍內(nèi)所得標準曲線的擬合方程為：=32666-2054（2=0.9996），線性關(guān)系良好．但在1.6 μg/mL和3.2 μg/mL處樣品主成分峰與周圍雜峰沒有完全分開（表1），不滿足藥典[16]關(guān)于分離度要大于1.5的要求．

而當流動相A與流動相B的比例為30:70時，SV主成分峰的保留時間為15.811 min（圖1B），在0.2~3.2 μg/mL范圍內(nèi)所得標準曲線的擬合方程為：=33782-1424.5（2=0.9999），線性關(guān)系關(guān)系良好，所有濃度樣品主成分峰分離度良好（表1），滿足藥典[16]要求．

圖1 SV標準品主成分峰保留時間

進一步對0.2、0.8和3.2 μg/mL 3個濃度SV溶液評價回收率測定結(jié)果顯示，該方法的平均回收率、日間及日內(nèi)精密度均較高（表2）．

表1 系列梯度濃度SV溶液HPLC法測定結(jié)果

表2 SV溶液平均回收率

此外，采用上述色譜條件對SVNs和SV進行分析時，空白納米膠束溶液和空白溶液均未對樣品主成分峰造成干擾，說明應(yīng)用上述HPLC法分析SV的專屬性良好（圖2）．因此，后續(xù)實驗應(yīng)用HPLC法檢測MG63細胞攝取入胞內(nèi)的SVNs中SV含量時，選擇流動相A與B的比例為30:70，其他色譜條件不變．

2.2 MG63細胞對SVNs和SV的攝取對比

MG63細胞對SVNs和SV的攝取情況見圖3．結(jié)果顯示，在SVG中，MG63細胞對SV的攝入十分迅速，15 min時胞內(nèi)藥物濃度即達到最高峰．而MG63細胞對SVNs的攝入速度較慢，從30 min開始，MG63對載藥膠束的攝入量才開始逐漸增多．SVNs被成骨細胞攝取速度較慢的原因可能與其粒徑過小及表面未帶電荷有關(guān)系．已有研究顯示，載藥納米膠束的粒徑、表面所帶電荷情況等都可影響細胞對載藥納米膠束的攝取．有學者[17]報道載藥納米膠束的粒徑在約50 nm時，其被細胞攝取的效率是最高的；而當納米表面帶正電荷時，可增加載藥納米膠束與細胞膜的吸附能力，從而增加其被細胞攝取的效率[18]．在今后的實驗中，通過控制SVNs的粒徑，并對其表面進行修飾，可增加其被細胞攝取的效率，從而發(fā)揮出更強的促細胞成骨分化作用．

圖2 HPLC法測定SV的專屬性色譜圖

圖3 MG63細胞對SVNs與SV在不同時間點的攝取情況（n=6; *P<0.05; **P<0.01）

同時，SVG中的胞內(nèi)SV含量在達到高峰后隨即迅速下降，這種現(xiàn)象在多形核白細胞攝取亞胺培南[19]、人牙周膜成纖維細胞攝取甲硝唑和替硝唑[20]及紅細胞攝取抗癌鉑的配合物[21]等實驗中均有出現(xiàn)．其可能的原因是，SV以被動擴散的方式進入胞內(nèi)后容易被水解代謝，導(dǎo)致含量下降；也可能是藥物與細胞膜相互作用使膜通透性發(fā)生改變，導(dǎo)致藥物漏出細胞外；此外，細胞膜上的外排蛋白是否也有參與，有待后續(xù)實驗加以驗證．

此外，在相同時間點，MG63細胞對SV和SVNs的攝取量除了在60 min時沒有顯著差異（＞0.05）外，在其他時間均存在顯著差異（＜0.05），其中，在加藥60 min后，MG63細胞對SVNs的攝取量顯著高于SV．由此可見，應(yīng)用納米膠束包載SV改變其劑型后，可顯著提高細胞內(nèi)SV的藥物濃度和存留時間，SVNs表現(xiàn)出較SV更強的成骨效能可能與此密切有關(guān)．

4 結(jié) 論

應(yīng)用HPLC法對MG63細胞攝取的SVNs中SV含量的直接定量檢測，并通過對比發(fā)現(xiàn)，加藥早期SVNs被細胞攝取的速度較SV慢，但SVNs可顯著提高SV在胞內(nèi)的濃度和作用時間，提示SVNs與SV被細胞攝取存在不同的方式，這可能是SVNs顯著提高SV促成骨效能的機制之一．

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Analysis the Uptake of Simvastatin-Loaded Nanomicelles in MG63 Cells by HPLC

NIU Mao1, FENG Xianling2, XU Youcheng1

（）

This experiment aims to quantitatively detect the uptake of simvastatin-loaded nanomicelles (SVNs) in human osteoblast-like cells (MG63 cells) by HPLC. First, the HPLC conditions for detecting simvastatin (SV) contained in SVNs were determined. And the specificity and accuracy of the method were evaluated. Secondly, the MG63 cells were incubated with SVNs and SV. The experiment was terminated at different times, and the cells were broken by frozen-thawed. The intracellular SV content were extracted and measured by using HPLC method. The results show that when the mobile phase ratio was 30:70 (V/V), the standard curve fitting equation for quantitative detection of SV contained in SVNs is=33782-1424.5 (2=0.9999), and the linear range was 0.2-3.2μg/mL. The specificity and accuracy of this HPLC method were higher, and the SV content in MG63 cells was successfully detected. At the same time, in the early stages of dosing, SVNs were taken up by MG63 cells more slowly than SV, but the intracellular drug content of SVNs was significantly higher than SV. There is a significant difference in the uptake of SVNs and SV by MG63 cells.

simvastatin; nanomicelles; high-performance liquid chromatography method; osteoblast; cellular uptake

2020-05-08

廣東省教育廳普通高校特色創(chuàng)新類項目資助（2018GKTSCX028）、廣東省醫(yī)學基金資助項目（A2018170）

牛茂，男，山西人，博士，副教授，研究方向：納米藥物在口腔醫(yī)學中的應(yīng)用．

R96

A

1672-0318（2020）05-0036-05