華北耬斗菜不同組織總DNA提取效果比較試驗研究

高姣姣 曾憲偉

摘? ?要：為進(jìn)一步開發(fā)利用華北耬斗菜資源并對其開展分子生物學(xué)研究，利用改良CTAB法提取華北耬斗菜植株的根、莖、葉、花和種子等5種組織總DNA，通過觀察提取過程中各組織的表現(xiàn)和紫外分光光度計檢測提取的總DNA，旨在找到最適宜提取總DNA的華北耬斗菜組織材料。結(jié)果表明：華北耬斗菜根、莖、葉、花和種子5種組織總DNA A260/A280比值依次為1.545、1.553、1.785、1.724、1.464，濃度為1 275 ng/μL、1 825 ng/μL、2 500 ng/μL、1 250 ng/μL、2 050 ng/μL。其中葉片總DNA提取效果最好，A260/A280比值接近純DNA（1.8～2.0），總DNA濃度達(dá)到2 500 ng/μL。因此，華北耬斗菜葉片更適宜用改良CTAB法提取其總DNA。

關(guān)鍵詞：華北耬斗菜;改良CTAB法;總DNA提取

文章編號： 1005-2690（2020）16-0004-03? ? ? ?中圖分類號： S63? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： B

耬斗菜屬（Aquilegia L.）植物的系統(tǒng)發(fā)育模式介于雙子葉植物擬南芥和單子葉植物水稻之間，是一種新興的模式植物[1]。因此，對其進(jìn)行分子生物學(xué)研究具有重要的意義。華北耬斗菜（Aquilegia yabeana Kitag.）為毛茛科耬斗菜屬多年生宿根草本植物，分布于華中、華北地區(qū)[2]。其葉型優(yōu)美，花型獨特似耬斗，花色深紫，花期較長，觀賞價值很高，常用作園林園藝花卉。此外，作為傳統(tǒng)中藥材，華北耬斗菜具有良好的治療月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)等婦科疾病的作用[3]。

開展分子生物學(xué)和遺傳育種學(xué)研究，提取核酸總DNA是首要且基礎(chǔ)的任務(wù)[4]。華北耬斗菜為草本植物，富含多糖、多酚和酯類等各種次生代謝產(chǎn)物，且組織特異性和各組織分化程度差異較大，不同組織及部位產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物種類和含量不一，各組織對試劑與提取過程各反應(yīng)條件的耐受能力強弱不同，因此，各組織總DNA提取效果存在一定的差異。研究表明，采用改良CTAB法提取植物總DNA，可以較為徹底地去除植物多糖，提取的核酸質(zhì)量和純度均較好，且提取方法簡單易操作[5-6]。

本研究采用改良CTAB法提取華北耬斗菜根、莖、葉、花和種子等5種不同組織的總DNA，通過觀察提取過程中各組織材料的表現(xiàn)差異和紫外分光法測定總DNA的A260和A280，比較分析各組織總DNA提取的效果，旨在找到適宜華北耬斗菜總DNA提取的最佳組織材料，從而提取到高質(zhì)量的總DNA，以期為華北耬斗菜的分子生物學(xué)研究提供一定的理論參考。

1? ?材料與方法

1.1? ?試驗材料

試驗材料采自呂梁學(xué)院藝術(shù)樓東側(cè)花圃，選擇生長狀況良好、無病蟲害的華北耬斗菜，為保證所獲取組織材料的均一性，根、莖、葉、花和種子均來自于同一植株。具體取材部位為：取自根系末端部位1 cm長度，直徑不超過0.2 cm的幼根;取自距離頂端幼芽1～2 cm且除去頂端幼芽及嫩葉的嫩莖;取自頂端幼芽處未展開至半展開的嫩葉;取自盛開的花朵，除去花蕾的花瓣;取自果莢里籽粒飽滿、種皮青綠色的半成熟種子。

1.2? ?試驗方法

1.2.1? ?改良CTAB法提取總DNA

在傳統(tǒng)CTAB法提取植物總DNA的基礎(chǔ)上，增加抗氧化劑和二次離心過程，具體操作方法及流程如圖1。

1.2.2? ?紫外分光光度計測定

通常核酸分子在紫外光260 nm處具有最大的光吸收值，而蛋白質(zhì)在紫外光280 nm處的光吸收值最大，在260 nm處的吸收僅為核酸的1/10或更低，故可以根據(jù)A260值和A260/A280比值分別推算出核酸濃度和DNA純度。1 μg/mL DNA在260 nm處光吸收值為0.02，DNA濃度（ng/μL）=[A260/0.020×比色皿厚度（cm）]×稀釋倍數(shù)。DNA純度可以根據(jù)A260/A280的比值來確定：當(dāng)A260/A280<1.8，表示蛋白質(zhì)含量較高;A260/A280>2.0，表示RNA含量較高;A260/A280=1.8～2.0，表示DNA較純。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?各組織總DNA提取過程效果比較

在華北耬斗菜根、莖、葉、花和種子等5種不同組織總DNA提取過程中，各組織的總DNA提取效果差異較大，見表1。

2.1.1? ?各組織的研磨效果

各組織研磨后的表現(xiàn)如圖2所示，華北耬斗菜各組織都比較均勻，莖類較難研磨，存在少許纖維素，其中可能含有較多分化完全的導(dǎo)管與篩管細(xì)胞;根類組織變褐現(xiàn)象嚴(yán)重，可能含有較多的多酚，易氧化變黑;花類組織含有較多的水分，研磨過程中色澤淡化，且色素被β-巰基乙醇還原為黃色;葉類組織研磨效果較好，質(zhì)地細(xì)膩均勻，色素較多;種子內(nèi)部可能含有較多的脂類物質(zhì)，研磨不夠充分，為淡黃色半流體膠狀物。

2.1.2? ?加入有機溶劑效果

加入24∶1氯仿/異戊醇結(jié)果如圖3所示，根、莖、葉和種子不易與24∶1氯仿/異戊醇分散，蛋白質(zhì)層較厚;花類組織材料與有機相分層明顯，大部分色素溶于基層有機相，少量色素溶于上清液，多糖、蛋白質(zhì)含量較少。

2.1.3? ?各組織離心分層效果

離心可使CTAB-蛋白質(zhì)/多糖絡(luò)合物加速沉淀，液體明顯分為3層，上層為溶解有DNA的高鹽緩沖液，中間層為CTAB-蛋白質(zhì)/多糖的復(fù)雜絡(luò)合物，下層為溶解有色素、酯類、酚類的氯仿/異戊醇。從圖4可以看出，根類組織上清液渾濁，有較多的多酚被氧化變?yōu)楹稚?莖、葉、種子類組織分層明顯，上清液清透，無明顯雜質(zhì)，分離效果較好;花類組織上清液仍有少量色素，且中間層多糖，蛋白類沉淀較松散，導(dǎo)致DNA回收率較低。

2.1.4? ?各組織總DNA沉淀效果

由于DNA不溶于異丙醇等有機溶劑，通過離心可使其沉淀下來。離心后沉淀如圖5，可以看出根的總DNA沉淀最少，且沉淀中有褐色雜質(zhì);莖的總DNA沉淀少，顏色半透明偏白;葉和種子的總DNA沉淀適中，顏色白，效果好;花瓣的總DNA沉淀少，為淺黃色，有色素雜質(zhì)殘留。

2.2? ?紫外分光光度計結(jié)果

各組織總DNA溶液紫外分光光度計檢測結(jié)果見表2。

從表2可以看出，華北耬斗菜不同組織總DNA A260/A280均低于1.80，說明所提取的總DNA溶液均含有蛋白質(zhì)雜質(zhì)。其中，葉片總DNA A260/A280比值為1.785，最接近1.8～2.0，且總DNA濃度達(dá)到2 500 ng/μL，可初步得出5種組織中葉類的總DNA純度、濃度均為最高，花瓣總DNA純度次之，但其DNA濃度較低，為1 250 ng/μL，產(chǎn)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如葉類組織，根、莖和種子的總DNA A260/A280比值均在1.5左右，表明其總DNA純度較低，蛋白質(zhì)雜質(zhì)較多。

3? ?討論

總DNA在植物不同組織內(nèi)分布不同，含量也有所差異，組織中不同的成分對總DNA提取的純度、濃度及產(chǎn)量均存在一定的影響[7]。楊運良等采用改良CTAB法對火龍果果肉、果皮、種子進(jìn)行總DNA提取發(fā)現(xiàn)，來自同一紅肉火龍果果實不同組織的總DNA濃度各不相同[8]。通過本研究對華北耬斗菜不同組織總DNA提取效果的比較發(fā)現(xiàn)，各組織總DNA濃度也各不相同，且A260/A280比值均在1.8以下，說明所提取的總DNA均存在一定量的蛋白質(zhì)雜質(zhì)，需進(jìn)一步去除。

其中，根、莖、葉、花和種子等5種不同組織中，根含有較多酚類物質(zhì)，褐變嚴(yán)重，大量雜質(zhì)影響總DNA純度，且總DNA發(fā)生降解，致使總DNA產(chǎn)量、純度都較低;莖干由于細(xì)胞高度分化，部分細(xì)胞形成大量纖維素，總DNA產(chǎn)量、純度一般;葉片含有大量葉綠體，總DNA含量豐富，色素易溶于氯仿，總DNA回收率高，產(chǎn)量、純度都較高;花瓣細(xì)胞含有大液泡，含水量多，蛋白質(zhì)/多糖成分少，離心后細(xì)胞碎片不易沉淀，導(dǎo)致總DNA純度較高但產(chǎn)量較低;種子中積累較多的可溶性糖與蛋白質(zhì)提取的總DNA存在較多雜質(zhì)，是導(dǎo)致其純度低的主要原因。李健仔等研究證明，葉類組織含有豐富的葉綠體DNA，其總DNA濃度與純度等提取效果表現(xiàn)良好[9]，與本試驗中葉類組織總DNA A260/A280比值和濃度均較高結(jié)果一致。

此外，李萌等以廟臺槭葉片和果實為試驗材料，探討了這2種不同組織DNA高效提取的方法[10]。劉泊鈺等分別采用了SDS法、CTAB法和試劑盒法共3種提取方法，比較分析了金線蓮根、莖、葉DNA提取的效果[11]。今后可繼續(xù)探究其他不同提取方法及其他影響總DNA提取效果的試驗因素等，對華北耬斗菜不同組織總DNA提取進(jìn)行優(yōu)化，為后續(xù)更好地進(jìn)行其分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

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