多肉植物大蒼角殿再生體系的建立

吳 霞，上官小霞

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花研究所，山西運城044000）

近年來，多肉植物因種類繁多、體態(tài)清雅、形狀奇特、色彩豐富等特點，逐漸成為盆栽品種，越來越受到消費者的喜愛[1]。隨著多肉市場的繁榮發(fā)展，普通的中低端產(chǎn)品已經(jīng)不能滿足多肉植物愛好者的需求，所以對中高端多肉植物品種的引種、擴繁及市場化培育成為國內(nèi)多肉植物產(chǎn)業(yè)發(fā)展的趨勢[2-3]。

大蒼角殿（Bowiea volubilis）是百合科蒼角殿屬植物，原產(chǎn)于南部非洲的干旱地區(qū)，是多年生草本多肉植物[4]。其特點是有一個綠色的大鱗莖，鱗莖頂端簇生細(xì)長綠色枝條，葉退化成線形，莖蔓分枝性佳，沿著支架纏繞攀爬，可依據(jù)個人喜好搭建不同觀賞造型，是目前國際上最流行的莖干狀多肉植物的代表種之一。但其繁殖速度較慢、繁殖成本較高，效率低，而且成年株開花較遲、結(jié)籽能力非常低，不易收獲種子；目前，國內(nèi)市場的大蒼角殿種子多為進(jìn)口，發(fā)芽率較低，這些因素嚴(yán)重制約了該品種的市場發(fā)展。植物組織培養(yǎng)技術(shù)因其培養(yǎng)周期短、繁殖率高、不受自然地理環(huán)境和季節(jié)限制等優(yōu)點，在良種快繁、無病毒苗的培養(yǎng)、種質(zhì)資源保存、次生代謝物生產(chǎn)等方面都得到了廣泛的應(yīng)用[5-10]。利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，可擺脫大蒼角殿自身特性的禁錮，起到快速繁殖、豐富品種的作用，有利于推動多肉植物市場繁榮，滿足多肉植物愛好者的需求。

目前，國內(nèi)對多種多肉植物的組織培養(yǎng)及再生體系已有較多研究報道，而且景天科、蘆薈科、仙人掌科、阿福花科、百合科等多個品種的組培再生體系已經(jīng)建立[11-14]。而對百合科多肉植物的組培再生研究主要集中在十二卷屬的品種[15-19]，對蒼角殿屬植物的組織培養(yǎng)及快速繁殖的研究還未見報道。

本研究通過組織培養(yǎng)的方法，探索了不同激素組合對多肉植物大蒼角殿幼嫩枝條外植體初代叢生芽誘導(dǎo)、叢生芽繼代培養(yǎng)以及芽苗生根的影響，旨在建立大蒼角殿無菌快速繁殖體系，對其種質(zhì)資源保存及推廣應(yīng)用具有重要的理論和實踐意義。

1 材料和方法

1.1 材料

以多年生大蒼角殿的當(dāng)年生幼嫩枝條為外植體。

1.2 方法

1.2.1 取材與消毒 小心剪取大蒼角殿當(dāng)年生幼嫩枝條，放入燒杯中用自來水沖洗干凈，轉(zhuǎn)入超凈工作臺進(jìn)行消毒處理，即用70%的酒精浸泡30 s，用無菌水沖洗2～3次；然后用0.1%的HgCl2溶液浸泡8～10 min，期間可輕輕晃動，倒去HgCl2溶液，用無菌水沖洗4～5次；將材料用濾紙吸干水分，切成1 cm左右的小段，備用。

1.2.2 培養(yǎng)條件 外植體的初代叢生芽誘導(dǎo)、叢生芽繼代增殖培養(yǎng)、芽苗生根培養(yǎng)均在組織培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行。培養(yǎng)室溫度為（26±2）℃，光照條件為1 500 lx左右、16 h/d。

1.2.3 培養(yǎng)方法 試驗以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同的激素進(jìn)行叢生側(cè)芽誘導(dǎo)及生根培養(yǎng)。培養(yǎng)基pH值均為5.8～6.2。MS培養(yǎng)基粉末購至美國PhytoTechnologyLaboratories公司；6-芐氨基腺嘌呤（6-Benzylaminopurine，6-BA）為細(xì)胞分裂素；1-萘乙酸（1-Naphthaleneacetic acid，NAA）和吲哚-3-乙酸（indol-yl-3-acetic acid，IAA）為生長素。

將配制好的培養(yǎng)基及時用高壓滅菌器進(jìn)行滅菌，滅菌條件為121℃滅菌15 min。其中，A1～A6培養(yǎng)基（A1.MS＋6-BA1.0 mg/L＋NAA0.1 mg/L＋3%蔗糖＋0.7%瓊脂；A2.MS＋6-BA 1.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L＋3%蔗糖＋0.7%瓊脂；A3.MS＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA0.1 mg/L＋3%蔗糖＋0.7%瓊脂；A4.MS＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L＋3%蔗糖＋0.7%瓊脂；A5.MS＋6-BA3.0 mg/L＋NAA0.1 mg/L＋3%蔗糖＋0.7%瓊脂；A6.MS＋6-BA 3.0 mg/L＋NAA0.2 mg/L＋3%蔗糖＋0.7%瓊脂）用于叢生芽誘導(dǎo)試驗；B1～B8培養(yǎng)基（B1.MS＋3%蔗糖＋0.7%瓊脂；B2.MS＋I(xiàn)AA 0.05 mg/L＋3%蔗糖＋0.7%瓊脂；B3.MS＋I(xiàn)AA 0.1 mg/L＋3%蔗糖+0.7%瓊脂；B4.MS＋I(xiàn)AA 0.2 mg/L＋3%蔗糖＋0.7%瓊脂；B5.1/2 MS＋3%蔗糖＋0.7%瓊脂；B6.1/2 MS＋I(xiàn)AA 0.05 mg/L＋3%蔗糖＋0.7%瓊脂；B7.1/2 MS＋I(xiàn)AA 0.1 mg/L＋3%蔗糖＋0.7%瓊脂；B8.1/2 MS＋I(xiàn)AA 0.2 mg/L＋3%蔗糖＋0.7%瓊脂）用于生根培養(yǎng)試驗。

在無菌條件下，將經(jīng)過消毒處理、切成1 cm左右的莖段分別接入A1～A6培養(yǎng)基，進(jìn)行初代側(cè)芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)；待誘導(dǎo)出的叢生側(cè)芽長到約1 cm大小時，用手術(shù)刀片將其分割，移入A3～A6培養(yǎng)基中進(jìn)行叢生側(cè)芽的繼代繁殖；待新長出的側(cè)芽約1.5 cm大小時，選取生長一致的側(cè)芽接入B1～B8生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。

1.2.4 煉苗與移栽 待植株長到8～10 cm大小、且根系生長旺盛時，打開培養(yǎng)瓶蓋進(jìn)行煉苗，3 d后移栽。移栽基質(zhì)火山巖∶赤玉土∶綠沸石∶泥炭體積比為1∶1∶1∶2，基質(zhì)混勻后經(jīng)高壓滅菌器滅菌，備用。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對大倉角殿外植體叢生芽誘導(dǎo)的影響

將消毒好的外植體切段接入到A1～A6培養(yǎng)基進(jìn)行初代叢生側(cè)芽的誘導(dǎo)，培養(yǎng)15 d左右，可觀察到切段兩端逐漸膨大；30 d左后可觀察到部分切段兩端誘導(dǎo)出叢生芽，另有一些未誘導(dǎo)出叢生芽的切段兩端有白色不定根生成。40 d后不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)外植體分化的結(jié)果如表1所示，細(xì)胞分裂素6-BA 質(zhì)量濃度為 1.0、2.0 mg/L（A1～A4）時，外植體分化率較低，而不定根的發(fā)生率則相對較高；當(dāng)6-BA 質(zhì)量濃度為 3.0 mg/L（A5、A6）時，外植體分化出從生側(cè)芽的比率明顯升高，同時不定根的發(fā)生率則明顯降低（表1、圖1）。

表1 不同培養(yǎng)基對大蒼角殿外植體叢生芽誘導(dǎo)的影響

由此可見，高濃度的細(xì)胞分裂素有利于誘導(dǎo)大蒼角殿外植體叢生芽的分化，利用A6培養(yǎng)基，初代叢生芽誘導(dǎo)率可達(dá)45.8%，叢生芽平均芽數(shù)達(dá)4個以上。

2.2 不同培養(yǎng)基對叢生芽增殖培養(yǎng)的影響

當(dāng)誘導(dǎo)出的初代叢生芽長至1 cm大小時，用手術(shù)刀片將叢生芽切開，接入不同的培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，進(jìn)一步誘導(dǎo)更多的叢生芽。與外植體誘導(dǎo)叢生芽相比，初代芽再分化出新芽的時間較短，一般21～28 d即可誘導(dǎo)出大量的叢生芽。從表2可以看出，A3～A5培養(yǎng)基誘導(dǎo)不定芽進(jìn)一步分化率無明顯的差異（培養(yǎng)28 d），皆為50%左右；A6培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化率相對較高，達(dá)61.5%，且芽長勢速率較快，長勢旺盛。考慮到后期需要多次進(jìn)行繼代培養(yǎng)，擴繁叢生芽，長期高濃度的激素培養(yǎng)會影響植物體內(nèi)的激素平衡，有可能導(dǎo)致后期叢生芽生長變異，所以，在叢生芽繼代培養(yǎng)過程中，推薦使用A3培養(yǎng)基進(jìn)行繼代繁殖及無菌種質(zhì)資源保存。

表2 不同培養(yǎng)基對叢生芽增殖培養(yǎng)的影響

2.3 不同培養(yǎng)基對芽苗生根的影響

繼代培養(yǎng)的叢生芽長到1.5 cm以上時，用手術(shù)刀片將其分割為單個個體，移入不同的生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)，15 d左右即可觀察到部分芽苗已經(jīng)有新根長出；30 d左右，部分幼苗根系可達(dá)3 cm以上，幼苗生長旺盛、長勢良好的植株株高可達(dá)8 cm以上。從表3可以看出，不同培養(yǎng)基配方對幼苗生根影響較大，1/2 MS培養(yǎng)基（B5～B8）生根情況優(yōu)于MS培養(yǎng)基（B1～B4），可見，降低礦物元素的含量有利于根的形成及生長。另外，添加不同濃度的生長素可以提高幼苗的生根率，其中，B8培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根率達(dá)最高，為86.7%，且根系生長良好。

表3 不同生根培養(yǎng)基對芽苗生根的影響

2.4 移栽結(jié)果分析

在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d以后，挑選根系生長良好、且幼苗植株生長健壯、株高7～8 cm的植株，揭開瓶蓋，煉苗3 d左右；然后用鑷子將瓶苗取出（操作過程中要小心，以免折斷根系）用自來水沖干凈根部培養(yǎng)基，然后插入移栽基質(zhì)中（圖2）。組培苗移栽初期，低溫高濕環(huán)境生長，14 d后可移到自然條件下生長。

3 結(jié)論與討論

本研究選用大蒼角殿當(dāng)年新生枝條為外植體，以MS為基本培養(yǎng)基進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)，結(jié)果表明，適宜叢生芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為MS＋6-BA 3.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L＋3%蔗糖＋0.7%瓊脂；適宜叢生芽繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS＋6-BA2.0mg/L＋NAA0.1 mg/L＋3%蔗糖＋0.7%瓊脂；最適生根培養(yǎng)以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，添加0.2 mg/L IAA，該培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d生根率可達(dá)86.7%。

大蒼角殿幼嫩枝條外植體消毒及初代叢生芽的誘導(dǎo)是成功建立其組培再生體系的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。以當(dāng)年生的幼嫩枝條切段作為外植體，在消毒過程中，要注意掌握HgCl2的消毒時間，消毒時間過短（5 min），外植體消毒不徹底，容易造成污染；消毒時間過長（15 mim以上），雖然可明顯降低外植體污染率，但外植體會受到傷害，容易褐化，死亡率增加。因此，要兼顧消毒效果以及對外植體的傷害程度，不同植物激素添加比例會影響外植體器官發(fā)生的方向，細(xì)胞分裂素和生長素比值較高時，可促進(jìn)芽的發(fā)生[20-21]。大蒼角殿外植體在初代叢生芽的誘導(dǎo)過程中，生長素含量一定時，低濃度的細(xì)胞分裂素可誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生不定根，從而抑制叢生芽的分化，在此階段，需要采用高濃度的細(xì)胞分裂素。本試驗使用的細(xì)胞分裂素質(zhì)量濃度最高為3.0 mg/L，叢生芽發(fā)生率小于50%。在以后的試驗過程中，可以適當(dāng)再增加細(xì)胞分裂素濃度，以摸索最適外植體誘導(dǎo)叢生芽分化的最佳激素配比，提高初代叢生芽分化比例。

不定芽的繼代培養(yǎng)過程中，雖然較高濃度的細(xì)胞分裂素可以誘導(dǎo)出更多的不定芽，且芽生長較快，但容易誘導(dǎo)出畸形芽，所以，在繼代培養(yǎng)過程中，適當(dāng)降低細(xì)胞分裂素濃度，有利于長期的組培及繼代培養(yǎng)叢生芽。長期使用激素誘導(dǎo)對植物從生芽生長狀態(tài)的影響以及最適宜的大蒼角殿組培快繁激素配比還需要進(jìn)一步研究。