溫針灸對慢性萎縮性胃炎大鼠局部穴區組織代謝的影響

曹佳男，鐘 歡，劉 密，2，羅曉婷，王英姿，常小榮*，馮 芳*

（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙410208；2.瀏陽市中醫醫院，湖南 瀏陽410300；3.郴州市第一人民醫院西院，湖南 郴州423000）

慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis， CAG）是臨床上一種常見的消化系統疾病，其主要病理特征為胃黏膜固有腺體萎縮、數目減少，胃黏膜變薄，黏膜基層增厚等。CAG 基礎上伴有腸腺化生或胃黏膜異型增生等病理表現的已經被歸為胃癌的癌前病變狀態，且有報道證實CAG 患者發生胃癌的風險偏高[1-2]。查閱相關文獻[3]，臨床證據顯示針灸治療CAG的效果明顯，主要包括針刺、艾灸、針刺-艾灸相結合、電針等療法。 課題組前期研究[4-7]證實針刺與艾灸對胃黏膜具有保護作用，且從代謝角度證實，不同干預手段下機體的代謝產物有差異，從而治療疾病。

代謝組學是繼基因組學、蛋白質組學之后的一種新興學科，是對生物體或者組織內的代謝物進行定量分析，并通過代謝物的差異分析代謝物與生理病理相對關系的一種技術[8]。 同時也可反映機體在整體環境下因不同干預方式引起代謝變化產生紊亂功能等。 這一特性與中醫學治療疾病的“整體思維”有著異曲同工之妙，提示代謝組學層面分析疾病狀態，可能有助于為中醫治療疾病提供循證依據[9-10]。本課題組前期有實驗證實[6]，針刺與艾灸分別對CAG大鼠胃組織、局部穴區組織代謝有著不同的影響，但對于將針刺與艾灸結合的溫針灸療法的相關論述目前暫缺乏考證。 溫針灸屬于中醫外治療法的一種，它是將針刺與艾灸有機結合起來，既有作用于穴位的刺激又有艾灸的灸熱刺激，共同起到活血化瘀、溫經通絡的作用。 陳智昌等[11]采用穴位埋線聯合溫針灸治療CAG 的臨床研究證實穴位埋線聯合溫針灸可有效改善臨床癥狀，且可修復胃黏膜，但對于作用機制尚不明確。 隨著課題組研究的逐漸深入，對溫針灸對于治療CAG 的具體機制存在疑問。由此本文將立足于代謝組學技術，觀察溫針灸對CAG 大鼠的治療作用，并分析對大鼠局部組織代謝物差異，以期為其臨床深入研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

42 只SPF 級雄性SD 大鼠，體質量（200±20） g，由湖南中醫藥大學動物實驗中心提供，許可證號：SYXK（湘）2013-0005。 適應性喂養1 周后，將大鼠分為正常組、模型組、模型+溫針灸組，每組14 只。每組分籠飼養。本實驗對動物的處理符合2006 年中華人民共和國科技部頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》相關規定。

1.2 主要試劑與儀器

N 甲基-N'-硝基-N 亞硝基胍（N-methyl-N-nitro-N-nitroso guanidine， MNNG，日本東京化成工業株式會社，75F7I-TF）；蘇木素-伊紅（Wellbio）；BA110S 萬分之一電子天平（德國Sartorius 公司）；TGL16M 臺式高速冷凍離心機（上海盧湘儀有限公司）；組織病理包埋儀(德國Leica 公司)；核磁共振儀Bruker AVANCE III HD 850 MHz（德國Bruker公司）。

1.3 模型制備

參考相關文獻并加以改進[12-13]，42 只SPF 級SD大鼠，適應性喂養1 周，分別采用MNNG 癌誘變劑、不規律進食以及40%無水乙醇灌胃制備CAG 大鼠模型：配制150 μg/mL MNNG 液體裝于包裹著錫箔紙的飲水瓶中，供各模型組大鼠飲用，并以第1 天足量飲食第2 天禁食為1 個循環，如此反復來制造不規律進食的模型。 此外，各模型組大鼠用40%的乙醇灌胃，每周2 次，間隔2～3 d 以模仿長期飲酒習慣，連續處理12 周。

第12 周每組大鼠隨機各取2 只處死，取胃組織，經過甲醛固定、梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅（HE）染色，在光鏡下觀察胃黏膜組織有無出現固有腺體萎縮，判斷造模成功與否[14]。

1.4 干預方法

腧穴選擇：中脘穴，足三里穴（雙），穴位定位參考實驗針灸學[15]。

溫針灸方法：消毒大鼠針刺穴位部位，將華佗牌一次性針灸針0.18 mm×25 mm 不銹鋼毫針刺入所選穴位上，直刺深度為5 mm，留針20 min，將規格為5.3 mm×85 mm 的細支艾炷（湖南高圣生物有限公司）裁剪為5.3 mm×15 mm 的艾柱，置于針灸針上，點燃，1 次/d，持續治療14 d。

1.5 標本采集及指標檢測

胃組織病理學觀察[4]：分別在模型評價時以及治療后觀察大鼠胃組織變化。 HE 染色：每次取材前需將大鼠禁食24 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后剖腹，鈍性分離胃體，剪開胃部，PBS 沖洗，在出現明顯病變處剪取胃組織標本，于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋、切片、HE 染色，400 倍光鏡下觀察標本病理變化。

代謝組學檢測局部穴區組織的采集及樣本制備：大鼠麻醉后以足三里為中心，5 mm×5 mm×5 mm的體積摘取大鼠局部穴區組織，液氮淬滅并保存在-80 ℃冰箱中。在處理樣品前，提前在-20 ℃冰箱中預冷，再從-80 ℃冰箱中取出穴區組織樣本，稱重，取（100±50） mg 的穴區組織。 在0 ℃條件下，按照4 mL/g 的比例加入甲醇、氯仿，2.85 mL/g 的比例加入雙蒸水勻漿、離心。 取上層清液（水相0.5 mL）轉移到新的離心管中，經氮吹儀濃縮去甲醇，冷凍干燥后溶于PBS 液中，并將上層清液550 μL 轉移到新的核磁管中，離心待檢測（1 000 r/min，5 min）4 ℃保存待檢測。

使用核磁共振儀Bruker Avance ⅢNMR 譜儀（850 MHz），使用1Dnoesygppr1d 譜脈沖序列（Bruker-Biospin pulse program library）采集1H-NMR。 實驗參數：實驗溫度為25 ℃，采樣點數（TD）為65 536，混合時間（τm）為120 ms，譜寬（SWH）16 ppm，弛豫延遲時間（D1）4 s，混合時間（D8）0.01 s，采樣時間（AQ）3.27 s，累加次數NS=128 次，空掃次數DS=4次。 用Chenomx NMR Suit 軟件（Chenomx Inc.，Edmonton， Canada）結合相關文獻及BMRB（http://www.bmrb.wisc.edu/metabolomics/）、HMDB（http://www.hmdb.ca/）等化合物化學位移數據庫，指認代謝物的共振信號，并挑選代表性樣品，采用COSY、TOCSY、J-resolved 等2D NMR 譜認代謝物的指認。 使用MestReNova 6.1 處理1H-NMR 譜。

1.6 統計學分析

計算機采集1H-NMR 氫譜圖，并對代謝物譜峰進行積分，通過主成分分析（PCA 分析）、偏最小二乘法（PLS-DA）分析，對個組大鼠代謝模式識別，結合正交偏最小二乘法（OPLS-DA）對差異物進行篩選。最后統計以變量的重要性值＞1 且滿足P＜0.05作為差異具有統計學意義的標準。

2 結果

2.1 胃組織病理學檢查

各模型組大鼠胃組織較正常組相比，組織黏膜層變薄，大量淋巴細胞浸潤，組織充血、水腫，腺體結構排列紊亂，以上符合CAG 病理診斷。治療2 周后，同模型組相比，模型+溫針灸組表現為固有腺體保持相對較完整，黏膜下有少量淋巴細胞浸潤。見圖1。

圖1 各組大鼠胃組織HE 染色圖（×400）

2.2 CAG 大鼠“足三里”穴區組織代謝的變化

PCA 分析對比正常組與模型組，二者代謝模式能夠較好區分，提示模型組大鼠局部穴區組織代謝模式發生了變化（圖2A）。 再將兩組結果進行PLSDA 建模，結果表明兩組樣本也可以被正確區分，且交叉驗證模型可靠（圖2B-2C）。 由于進行CAG大鼠“足三里”局部穴區組織差異性代謝物分析之前需要進行OPLS-DA，結果分析表明正常組與模型組大鼠穴區組織代謝模式在第一預測主成分上可以很好區分（圖2D）。 OPLS-DA 維載荷圖表明，相對于正常組，模型組穴區組織中谷氨酰胺（Gln）、琥珀酸（Suc）、賴氨酸（Lys）、富馬酸（Fum）、次黃嘌呤（HX）、一磷酸腺苷（Amp）顯著降低；N-乙酰天門冬氨酸（NAA）、天冬氨酸（Asp）、天冬酰胺（Asn）、磷酸膽堿/甘 磷 酸 膽 堿（PC/GPC）、酪 氨 酸（Tyr）、苯 丙 氨 酸（Phe）、黃嘌呤（Xan）、肌苷（Ino）顯著升高（圖2E）。

2.3 溫針灸對CAG 大鼠局部穴區組織代謝的影響

如圖3A 所示，模型組與模型+溫針灸組對比，顯示模型+溫針灸組有兩個樣本與模型組重疊，但整體區分趨勢清晰；隨后對兩組進行PLS-DA 建模，如圖3B 所示，兩組樣本明顯區分，且交叉驗證（圖3C）表明模型可靠。 OPLS-DA 得分（圖3D）結果表明，兩組大鼠穴區組織代謝模式在第一預測主成分上可以很好區分可以。 而維載荷圖中，模型+溫針灸組大鼠穴區組織產生的差異性代謝物為乳酸（Lac）、N，N-二甲基甘氨酸（DMG）、肌醇（m-I）、一磷酸腺苷（AMP）、腺苷（Ade）、次黃嘌呤（HX）顯著升高，而Bet、蘇氨酸（Thr）、磷酸膽堿（PC）、甘磷酸膽堿（GPC）、二磷酸腺苷（ADP）、肌苷（Ino）顯著降低（圖3E）。

圖2 正常組和模型組大鼠穴區組織代謝模式圖

3 討論

代謝組學是一種兼顧檢測和評估由于疾病或其他刺激方式引起生物體機體內源性代謝成分變化的技術[16]，通過檢測代謝物的變化進行代謝譜分析檢測和診斷生物標志物來了解人體整個生命過程中發生的改變[17-18]。 本實驗基于代謝組學技術從代謝物層面分析總結當機體在接受到相應刺激時，代謝模式發生的變化、出現的差異性代謝物以及各代謝物之間變化的相關性。

同正常組大鼠相比，模型組大鼠局部穴區組織有14 個差異性代謝物。 其中濃度降低的代謝物有：谷氨酰胺、琥珀酸、賴氨酸、富馬酸、次黃嘌呤、一磷酸腺苷，升高的代謝物：N-乙酰天門冬氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、磷酸膽堿/甘磷酸膽堿、酪氨酸、苯丙氨酸、黃嘌呤、肌苷。谷氨酰胺分解產生的谷氨酸可通過增加一氧化氮生成、超氧化物歧化等一系列反應減少黏膜損傷[19]，谷氨酰胺、谷氨酸和天冬氨酸的代謝為腸道完整性和功能維持提供大量的三磷酸腺苷[20]，參與能量代謝與炎癥反應密切相關[21]。以上提示CAG 病理狀態下大鼠局部穴區組織的能量代謝出現紊亂。

圖3 模型組和模型+溫針灸組大鼠穴區組織代謝模式圖

同模型組相比，溫針灸干預后，大鼠“足三里”局部穴區組織的代謝發生了改變：甜菜堿、蘇氨酸、磷酸膽堿、甘磷酸膽堿、二磷酸腺苷、肌苷含量降低；乳酸、N，N-二甲基甘氨酸、肌醇、一磷酸腺苷、腺苷、次黃嘌呤的含量有所升高。一磷酸腺苷是一種腺嘌呤核糖核苷酸，由三磷酸腺苷兩次水解得到，在能量代謝上起著重要作用。 而腺苷是用于合成三磷酸腺苷、腺嘌呤、腺苷酸等重要的中間體，在溫針灸干預后磷酸腺苷、腺苷含量回調，提示溫針灸可以增加局部組織的能量代謝。 次黃嘌呤是核酸代謝的產物，在次黃嘌呤氧化酶的作用下轉化成黃嘌呤，溫針灸回調次黃嘌呤的含量同樣證實溫針灸可增強CAG大鼠機體的核酸代謝[22]。以上分析提示，溫針灸干預主要調節CAG 大鼠穴區組織的核酸代謝及能量代謝方面。

綜上所述，溫針灸可調節CAG 大鼠局部穴區組織代謝物的含量。雖然目前代謝組學技術已經廣泛應用到中醫各領域，但由于代謝組學技術的特性，其后期數據挖掘較復雜且困難，準確尋找作用機制還需深入研究，以期為臨床選擇治療方法提供強有力的依據，從而進一步提高針灸治療疾病的臨床療效。