滋腎活血方通過PINK1/Parkin 信號通路增加自噬對血管性癡呆大鼠的影響

謝 樂，伍大華*，曹思佳，任晨斌，劉 涵

（1.湖南省中醫藥研究院附屬醫院腦病科，湖南 長沙410006；2.湖南中醫藥大學人文與管理學院，湖南 長沙410208；3.寧波市北侖區中醫院內科，浙江 寧波315800；4.湖南中醫藥大學研究生院，湖南 長沙410208）

血管性癡呆（vascular dementia， VD）是指由一系列腦血管因素導致腦組織損害引起的以認知功能減退為特征的一組臨床綜合征，是僅次于阿爾茨海默病的第二大癡呆類型[1]。 世界衛生組織統計，目前全世界有3 560 萬VD 患者，并以770 萬/年的速度遞增[2]。 我國有540 萬VD 患者，預計到2050 年VD患者人數達到現在的3 倍，給家庭和社會帶來沉重的經濟負擔[3]。 VD 是目前唯一可防治的癡呆類型，并且這種防治主要針對VD 的早期階段[4]。研究團隊前期研究發現滋腎活血方能改善VD 患者學習記憶能力評分，如簡易智力狀態檢查量表（MMSE）評分、日常生活能力評分（ADL）以及中醫證候積分等[5]。并且發現其機制可能與上調NR1、NR2A、NR2B，增加CaM、CaMPKⅡ蛋白及mRNA 的表達相關[6-7]。 因諸多文獻報道NR 表達上調可激活細胞自噬，保護受損神經元[8-9]，故研究團隊進一步研究滋腎活血方在改善VD 大鼠學習記憶能力方面的影響， 為VD 的防治提供新的思路與方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性SPF 級SD 大鼠50 只，體質量220～250 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，批號：SYXK（湘）2015-0008，在湖南省中醫藥研究院動物平臺自由進食喂養，環境溫度控制在（25±2） ℃，濕度為（50±5）%，所有大鼠適應環境喂養1周后開始實驗。

1.2 實驗藥品、試劑與儀器

滋腎活血方由枸杞子、制何首烏、益智仁、桑椹、丹參、葛根、石菖蒲、遠志、五味子、郁金、全蝎、山楂組成，均購自湖南省中醫藥研究院附屬醫院。奧拉西坦膠囊購自石藥集團歐意藥業有限公司（批號：059160250），Anti-LC3II、Anti-Beclin1、Anti-PINK1、Anti-Parkin 等抗體購自英國Abcam 公司，辣根酶標記鏈親和素、Goat Anti-Rabbit IgG/HRP、DAB 顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司，4%多聚甲醛購自Biosharp 公司，檸檬酸鈉購自國藥集團化學試劑有限公司，切片機（Leica UC7）購自德國Leica 公司，倒置顯微鏡（TH4-200 型）購自日本Olympus 公司。

1.3 動物造模

采用改良2-VO 法制作VD 大鼠模型[10]，大鼠術前禁食禁水，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定，脫毛膏備皮，碘酊消毒，沿頸部正中線切開皮膚，鈍性分離左頸總動脈，采用4-0 手術縫線雙重結扎，縫合傷口，消毒。7 d 后采用同樣方法結扎右頸總動脈，縫合傷口，消毒。假手術組予以分離頸總動脈但不結扎。

1.4 動物分組及給藥

術后7 d 行水迷宮測試，以正常組大鼠逃避潛伏期(escape latency， EL)的平均值為參考值，計算每只造模大鼠逃避潛伏期與參考值之差占該鼠逃避潛伏期的比值，若該值＞20%為癡呆鼠[11]。 剔除大鼠游泳姿勢不良以及未明顯癡呆的大鼠。

1.5 動物分組及給藥

造模成功后將大鼠隨機分為假手術組、模型組、低劑量組、高劑量組、陽性組，每組10 只。低劑量組予以相當于人常規劑量滋腎活血方[17.8 g/(kg·d)]灌胃，高劑量組予以相當于人2 倍常規劑量滋腎活血方[35.6 g/(kg·d)]灌胃，陽性組予以相當于人常規劑量的奧拉西坦膠囊[216 mg/(kg·d)]灌胃，劑量換算參照徐叔云主編《藥理實驗方法學》[12]，連續灌胃4 周。

1.6 免 疫 組 化 法 檢 測LC3II、Beclin1、PINK1 以 及Parkin 蛋白的表達

大鼠處死后取腦組織，4%多聚甲醛固定，切片，二甲苯脫蠟3 次，乙醇洗脫，將切片置于檸檬酸鈉溶液中進行抗原修復，加入過氧化酶阻斷劑以阻斷內源性過氧化氫酶的活性，加入50 μL 用稀釋液稀釋后的一抗，室溫孵育1 h，加入50 μL 二抗（生物素標記的羊抗鼠/兔IgG），室溫孵育30 min，DAB 顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片。倒置顯微鏡下觀察，棕黃色結構為陽性表達，使用Image-Pro Plus 6.0 軟件檢測陽性結構的面積和強度（光密度），采用積分光密度（IOD）來表示陽性表達的水平，IOD=陽性面積×光密度[13]。

1.7 統計方法

2 結果

2.1 滋腎活血方對VD 大鼠海馬組織自噬標記蛋白LC3II、Beclin1 表達的影響

免疫組化結果顯示：滋腎活血方各組干預4 周后，VD 大鼠海馬組織自噬標記蛋白LC3II、Beclin1表達明顯增加（P＜0.01）。 單因素方差分析顯示低劑量組與高劑量組之間結果，差異無統計學意義（P＞0.05），而陽性組并不能增加自噬標記蛋白LC3II、Beclin1 表達（P＞0.05），提示奧拉西坦可能不是通過影響細胞自噬改善VD 學習記憶能力（見表1，圖1-2）。

表1 滋腎活血方對VD 大鼠海馬組織LC3II、Beclin1、PINK1、Parkin 蛋白表達的影響（±s，n=10）

表1 滋腎活血方對VD 大鼠海馬組織LC3II、Beclin1、PINK1、Parkin 蛋白表達的影響（±s，n=10）

注：與假手術組比較，**P＜0.01

組別假手術組模型組陽性組低劑量組高劑量組LC3II（×103）86.42±15.77 88.21±11.78 P=0.83 81.1±13.98 P=0.53 140.28±17.18**P=0.00 130.54±22.38**P=0.00 Beclin1（×103）160.42±30.01 151.95±33.03 P=0.66 164.26±40.24 P=0.84 274.99±44.22**P=0.00 261.25±41.36**P=0.00 PINK1（×103）106.17±12.22 114.32±26.50 P=0.22 104.48±21.25 P=0.22 151.49±29.42**P=0.00 146.93±29.12**P=0.00 Parkin（×103）116.53±29.76 131.29±17.45 P=0.51 131.04±21.76 P=0.89 176.68±21.83**P=0.00 186.22±24.32**P=0.00

圖1 滋腎活血方對VD 大鼠海馬組織LC3II 表達的影響（×400）

圖2 滋腎活血方對VD 大鼠海馬組織Beclin1 表達的影響（×400）

2.2 滋腎活血方對VD 大鼠海馬組織PINK1/Parkin表達的影響

免疫組化結果表明，干預4 周后，滋腎活血方各組，均能顯著提高VD 大鼠海馬PINK1、Parkin蛋白的表達水平（P＜0.01）。 單因素方差分析結果顯示低劑量組與高劑量組之間，差異無統計學意義（P＞0.05），而 陽 性 組PINK1、Parkin 蛋白的表達并無明顯變化（見表1，圖3-4）。

3 討論

中醫學并無VD 的病名，因VD 多見于中風之后，故可歸屬于“中風癡呆病”范疇。課題組對VD 的現代文獻進行了系統研究[14-15]，并對其證型進行了流行病學調查[16]，結果均證實“腎精陰虛、瘀血阻絡”為VD 的主要病機。針對該病機，課題組在國醫大師劉祖貽的帶領下創制了以滋腎填精、活血通絡為治法的滋腎活血方，經臨床研究證實其能顯著改善VD 患者學習記憶能力評分，如MMSE 評分、ADL評分以及中醫證候積分等[5]。并且發現其機制可能與上調NR1、NR2A、NR2B，增加CaM、CaMPKⅡ蛋白及mRNA 的表達有關[6-7]。

圖3 滋腎活血方對VD 大鼠海馬組織PINK1 表達的影響（×400）

圖4 滋腎活血方對VD 大鼠海馬組織Parkin 表達的影響（×400）

因諸多文獻報道NR 激活可誘導細胞自噬，保護受損神經元。 采用NR 的配體興奮性氨基酸NMDA短時間處理（3 h）可以提高大鼠小腦顆粒神經元細胞胞體及神經突的LC3II 和Beclin-1 水平，而當處理時間延長至8～24 h 時則出現MDC-、LC3-陽性的自噬小體，提示興奮性氨基酸誘導細胞自噬[17]。Li Y 等[18]研究發現NMDA 與突觸后膜上的NR 受體結合，激活Fyn-NR2B-CaMKII 信號途徑，增加NR2B pY1472 位點的磷酸化，誘導神經元自噬。基于上述研究基礎，故研究團隊進一步探究細胞自噬在滋腎活血方改善VD 大鼠學習記憶能力方面影響，發現滋腎活血方能顯著增加自噬標記蛋白LC3II、Beclin1 的表達，提示滋腎活血方能增加缺血海馬神經元的自噬，從而保護神經元，改善VD 大鼠學習記憶能力。

PINK1/Parkin 通路是經典的介導細胞自噬的通路，PINK1 是一種蛋白激酶，主要在細胞質中合成，多余的PINK1 經線粒體內外兩層膜進入線粒體內，被線粒體蛋白酶MPP 和PARL 酶剪切并運回胞漿，最終被降解而代謝。 但當神經元受到缺血缺氧損傷后，早期出現線粒體膜電位下降，導致PINK1 不能跨越線粒體外膜向線粒體內轉移，不能被代謝而積累于線粒體外膜上。 線粒體外膜上積聚的PINK1 則招募并活化細胞漿中E3 泛素化酶Parkin，Parkin 活化后與LC3 結合，形成自噬小體，自噬小體與溶酶體進一步結合形成自噬溶酶體，從而清除受損細胞成分，發揮保護細胞的作用[19]。 目前，暫無PINK1/Parkin 信號通路在VD 發病機制中的研究報道，但可見在腦缺血損傷中的神經保護作用報道。 Anatoly Uzdensky 等[20-21]發現采用光化學法建立大鼠腦梗死模型，4 h 后即可觀察到缺血半暗帶PINK1、Parkin蛋白表達的上調，提示PINK1/Parkin 信號通路激活可以保護缺血損傷神經元。本研究結果顯示滋腎活血方改善VD 大鼠學習記憶能力與上調PINK1/Parkin 信號分子相關。

課題組在前期研究的基礎上，采用改良2-VO法建立VD 大鼠模型，結果顯示滋腎活血方能顯著提高自噬標記蛋白LC3II、Beclin1 以及自噬調控PINK1/Parkin 信號分子的表達，提示滋腎活血方可能通過激活PINK1/Parkin 信號通路，促進細胞自噬，保護VD 大鼠神經元，改善其學習記憶能力。