益心泰對慢性心力衰竭大鼠心室重構及p-p38MAPK、β-arrestin 蛋白表達的影響

孫 濤，李 雅*，郭志華，，龍 云，曾 英，王 月

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙410007；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙410208）

隨著多數心血管疾病得到良好的診治，慢性心力衰竭(chronic heart failure， CHF)所帶來的問題越來越突出，現已成為人類健康道路上最大的敵人之一，絕大多數心血管疾病發展到終末期都會并發心力衰竭。 研究表明，心室重構在心力衰竭發生和發展的過程中扮演重要角色[1]。 而β-arrestin 的偏向激活作用在心室重構中的發揮也得到了越來越多的關注。 近期研究證實，成功抑制β-arrestin 介導的p38MAPK 信號通路對心肌有保護作用[2]。 中藥復方益心泰長期應用于慢性心力衰竭患者的臨床治療，且療效已得到充分肯定[3-6]。本課題組前期研究已經證明，益心泰能夠通過抑制G 蛋白偶聯受體，延緩心力衰竭[7]，但是否能夠抑制β-arrestin 介導的p38MAPK 信號通路尚不清楚。本研究通過觀察益心泰對慢性心力衰竭大鼠心室重構時β-arrestin、p-p38MAPK 蛋白表達的影響，試圖闡明益心泰抗心室重構的多重作用機制，為將其應用于臨床提供充分的理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物

SD 大鼠60 只，雄性，清潔級，體質量200～230 g，由湖南省人民醫院動物中心提供，許可證號：SCXK（湘）2016-0002。

1.2 藥物、試劑與儀器設備：

益心泰由湖南中醫藥大學第一附屬醫院中成藥制劑中心提供的醫院制劑，主要由黃芪、紅花、豬苓等組成；卡維地洛由山東齊魯制藥有限公司提供(批號：201800035)，商品名：金絡，10 mg/片；β-arrestin蛋白表達試劑盒（湖南玉堂生物試劑公司）；兔抗鼠p38MAPK 抗體(北京博奧森公司)；AEV-210 電子分析天平(長沙湘儀天平儀器廠)；Vivid 7.0 彩色超聲儀（美國GE 公司）；UV-365 型紫外分光光度計(日本島津)。

1.3 模型制備與動物分組

60 只清潔級SD 雄性大鼠中，隨機數字表法選取10 只設正常對照組，其余50 只采用腹腔注射鹽酸阿霉素法建立心衰大鼠模型[8]，按第1 次和第2次1.0 mg/（kg·d）劑量給藥，第3 次和第4 次2.0 mg/（kg·d）劑量給藥，第5 次和第6 次1.0 mg/（kg·d）劑量給藥，第7 次和第8 次2.0 mg/（kg·d）劑量給藥，累積劑量12 mg/kg，隔天注射，共計15 d，觀察大鼠表征及行為改變。 于第16 天完成心臟彩超檢查，以左室射血分數(LVEF)為參考指標，數值低于40%作為心力衰竭模型成功的標志，同時大鼠出現體質量減輕、活動減少、精神萎靡、毛色黯淡無光澤，列入觀察對象。在符合上述標準的大鼠中，隨機選取30 只，再隨機分為3 組：益心泰組2.0 g/（10 mL·kg)；卡維地洛組10 mg/（10 mL·kg)；正常對照組及模型組(生理鹽水等容積)，各組均為每日給藥1 次，連續灌胃給藥8 周，觀察整個實驗過程中大鼠一般情況。給藥8周后，檢測大鼠心室重構指標及β-arrestin、p-p38MAPK蛋白表達情況。

1.4 各項指標的測定

1.4.1 左室結構觀測 采用Vivid 7.0 彩色超聲儀進行檢測。 分別取胸骨旁左室長軸切面和心尖兩腔心切面，由二維超聲引導M 型曲線并進行測量。 測量指標為左心室后壁厚度（posterior Wall thicknessin diastole， PWD）、室間隔厚度(interventricular septal thickness at end diastole， IVSD)、左心室舒張末期內徑(left ventricular end diastolic dimension，LVEDD)、左心室收縮末期內徑(Left ventricular end-systolic dimension， LVESD)，均 記 錄 連 續3 個 心 動 周 期 數值，再取平均值。

1.4.2 心室重構指標檢測 左心室重量指數(left ventricular weight index， LVWI) 和右心室重量指數(right ventricular weight index， RVWI)，左心室濕重/體重即左心室重量指數；右心室濕重/體重即右心室重量指數[9]。

1.4.3 Western blot 檢測β-arrestin、p-p38MAPK 蛋白表達 采用Western blot 檢測β-arrestin、p-p38MAPK蛋白的相對表達，洗膜后用GE AI600 多功能成像儀掃描條帶，并用Gel-Pro Analyzer 4.0 軟件對結果進行分析比對。

1.5 統計學方法

運用SPSS 19.0 軟件進行統計學分析，檢驗均采用雙側檢驗，P＜0.05 即認為檢驗的差異具有統計學意義。結果以“±s”表示，先行正態檢驗和方差齊性檢驗，若滿足正態性及方差齊性，行單因素方差分析；若不滿足采用非參數檢驗。

2 結果

2.1 左室結構變化情況比較

與正常對照組比較，模型組左室后壁、室間隔厚度明顯降低，左心室舒張末期內徑及收縮末期內徑均明顯增加，差異具有統計學意義(P＜0.01)；與模型組進行比較，益心泰組、卡維地洛組左室后壁、室間隔厚度增加，左心室舒張末期內徑及收縮末期內徑減少，差異均有統計學意義(P＜0.05)；益心泰組與卡維地洛組各項指標組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。 見圖1 和圖2。

圖1 各組室間隔及左室后壁厚度變化情況

圖2 各組左室舒張末內徑及收縮末內徑變化情況

2.2 心室重構指標變化情況

與正常對照組比較，模型組左、右心室重量指數明顯增大，差異具有統計學意義(P＜0.01)。 與模型組比較，益心泰組、卡維地洛組左、右心室重量指數均降低，差異均有統計學意義(P＜0.05)，益心泰組與卡維地洛組各項指標組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。 見圖3。

圖3 各組左右心室質量指數變化情況

2.3 β-arrestin、p-p38MAPK 蛋白表達情況

與正常對照組比較，模型組β-arrestin 蛋白表達明顯下降，p-p38MAPK 蛋白表達顯著增加，差異具有統計學意義(P＜0.01)；與模型組比較，益心泰組、卡維地洛組β-arrestin 蛋白表達增加，p-p38MAPK蛋白表達減少，差異具有統計學意義(P＜0.05)；益心泰組與卡維地洛組各項指標組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。 結果見圖4。

圖4 各組β-arrestin、p-p38MAPK 蛋白表達情況

3 討論

前期研究表明，β-arrestin 蛋白家族屬于一種腳手架蛋白，多種信號蛋白可以被它募集，根據募集蛋白的不同，β-arrestin 會調節7 次跨膜受體，產生不同的效應，如去磷酸化、泛素化、反式激活等[10]。隨著研究的深入，β-arrestin 越來越多的作用被發現，它作為腳手架蛋白的同時也是一類信號分子，且不依賴于G 蛋白；β-arrestin 亦屬于接頭蛋白，可以與體內多種激酶與目標蛋白相互作用；β-arrestin 能夠激活表皮生長因子，并在此過程中發揮關鍵作用[2]。 由于其作用靶點多樣，功能豐富，已經成為藥物研發的新目標。 同時，p38MAPK 作為β-arrestin 的下游重要靶點，也受到越來越多的關注。 p38MAPK 廣泛分布于人體細胞內，且可被多種因素激活，例如輻射、炎癥、缺氧、細胞因子等[11-12]。 p38MAPK 的激活與心力衰竭的發生有著明確關系，研究已證明p38MAPK磷酸化后誘發心力衰竭的主要機制是啟動心肌細胞凋亡，進而誘發心室重構[13-15]。 本研究已經證明益心泰和卡維地洛對大鼠心室重構有顯著的抑制作用，如圖1、2 所示兩治療組均改善了左室結構，降低了左、右心室重量指數。 從圖3 可知，益心泰組和卡維地洛組β-arrestin 蛋白表達增加，p-p38MAPK 蛋白表達減少，與模型組及正常對照組比較，差異均具有統計學意義。 綜上結果可知，益心泰抑制心室重構作用顯著，其作用機制可能是通過調節心肌細胞內的β-arrestin、p-p38MAPK 蛋白表達實現的。

心力衰竭臨床上以呼吸困難、水腫、乏力等癥狀為主要表現，在中醫學中屬“喘證”“水腫”“虛證”等范疇。 其共同病機為“本虛標實”，又以氣虛為主，氣虛則血虛，氣虛則血瘀，氣虛則水停。 益心泰是遵從上述理論指導，結合導師多年臨床經驗總結而成的中藥復方，由黃芪、紅花、豬苓等藥物組成，該復方主要針對的病機是氣虛血瘀水停。方中黃芪用量最重，為君藥，可補氣之不足；紅花為臣藥，活血化瘀，因其入心經，在本方中兼作使藥；豬苓為佐藥，利水消腫，配合余藥，共奏益氣活血利水之功。

綜上所述，本研究表明益心泰有效調節心肌細胞內的β-arrestin、p-p38MAPK 蛋白表達，從而明顯抑制心室重構。但β-arrestin 介導的p38MAPK 信號通路作用機制具有多樣性，且步驟非常復雜，仍需進一步深入研究。