超聲提取黃精總酚工藝的響應(yīng)面法優(yōu)化

馮庭輝，賈巧君，郭暉，金美艷，陳喜良，劉峰，梁宗鎖*

(1.浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 杭州 310018； 2.新鄉(xiāng)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453000；3.浙江萬壽康生物科技有限公司，浙江 武義 321200； 4.陜西步長制藥集團(tuán)公司，陜西 西安 710000)

黃精藥材為天門冬科(Asparagaceae Juss.)黃精屬(PolygonatumMill.)黃精(PolygonatumsibiricumRed.)的干燥根莖。黃精是傳統(tǒng)的藥食同源中藥[1-2]，味甘、性平、無毒，主要分布于甘肅和陜西，特別是在秦嶺地區(qū)蘊(yùn)藏量極大[3]。黃精的藥用歷史已有2 000多年，其根入藥性平而潤，味甘而淡，可補(bǔ)中益氣、定肝膽、潤心肺[4-5]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，黃精具有提高免疫系統(tǒng)功能、抗衰老、抗氧化、抗腫瘤、強(qiáng)心、降血脂等藥理作用[6-10]。在我國古代，黃精就被作為“長生不老”和“延年益壽”的藥用植物而被使用和認(rèn)知[11]。

目前，關(guān)于黃精化學(xué)成分的研究主要集中在多糖上[12]，對(duì)黃精多酚的研究報(bào)道較少[13-15]。植物多酚具有抗氧化、預(yù)防心血管疾病、抗癌、抗菌消炎、抗病毒等作用[16-19]。目前，黃精多酚的提取多以乙醇為溶劑，采用超聲波輔助提取的工藝報(bào)道較少見[20-21]，且不同研究的黃精多酚得率相差較多:吳其國等[20]研究了安徽不同產(chǎn)地野生與栽培多花黃精的總酚含量，在3.46～5.22 mg·g-1；焦劼等[21]報(bào)道不同產(chǎn)地黃精總酚含量呈正態(tài)分布。但在本研究范圍內(nèi)，關(guān)于黃精總酚提取工藝中各項(xiàng)參數(shù)對(duì)提取效果的影響尚未見報(bào)道。

響應(yīng)面分析法通過建立數(shù)學(xué)模型能夠精確地計(jì)算出各個(gè)因素對(duì)研究目標(biāo)的響應(yīng)值[22]，被越來越多的中藥材成分提取優(yōu)化研究所使用，如解紅霞等[23]利用響應(yīng)面法優(yōu)化芹葉鐵線蓮中總皂苷的提取工藝等。本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取溫度、超聲時(shí)間和超聲次數(shù)3個(gè)主要因素，采用響應(yīng)面分析法，以黃精總酚得率為響應(yīng)值，對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為黃精多酚的提取研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃精藥材，陜西略陽黃精GAP(中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范)基地提供，經(jīng)浙江理工大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)藥學(xué)院浙江次生代謝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定為天門冬科植物黃精的干燥根莖。

無水乙醇，杭州高晶精細(xì)化工有限公司；沒食子酸，上海源葉生物科技有限公司；福林酚顯色劑，北京索萊寶科技有限公司；Na2CO3，杭州高晶精細(xì)化工有限公司。所有分離用有機(jī)溶劑均為分析純。

全自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國BioTek；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；400g搖擺式高速中藥粉碎機(jī)，溫嶺市林大機(jī)械有限公司；精密可編程熱風(fēng)循環(huán)烘箱，立德泰勀(上海)科學(xué)儀器有限公司；純水儀。

1.2 黃精總酚的提取與測定

精確稱取黃精細(xì)粉0.5 g于試管中，加入一定量不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇，超聲(250 W，40 kHz)提取一定時(shí)間，離心，分離上清液與底部黃精粉，在剩余黃精粉中加入70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇，進(jìn)行下一次超聲提取。反復(fù)提取3次，合并濾液。準(zhǔn)確吸取40 μL，依次加入3.2 mL蒸餾水、200 μL福林酚顯色劑，充分振蕩后靜置6～8 min，加入500 μL 15%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))Na2CO3溶液，搖勻后在室溫下避光放置，反應(yīng)2 h，在765 nm波長處測定吸光值。

1.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 料液比對(duì)提取率的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、提取溫度為30 ℃、超聲30 min、超聲次數(shù)為3次的條件下，將料液比分別設(shè)定為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80，探索料液比對(duì)黃精總酚提取率的影響。

1.3.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響

在提取溫度為30 ℃、料液比為1∶50、超聲30 min、超聲次數(shù)為3次的條件下，將乙醇體積分?jǐn)?shù)分別設(shè)定為40%、50%、60%、70%、80%、90%，探索乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃精總酚提取率的影響。

1.3.3 提取溫度對(duì)提取率的影響

在料液比為1∶50、乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、超聲時(shí)間為30 min、超聲次數(shù)為3次的條件下，將提取溫度分別設(shè)定為20、30、40、50、60 ℃，探索提取溫度對(duì)黃精總酚提取率的影響。

1.3.4 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響

在超聲溫度為30 ℃、料液比為1∶50、乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、超聲次數(shù)為3次的條件下，將超聲時(shí)間分別設(shè)定為20、30、40、50、60 min，探索超聲時(shí)間對(duì)黃精總酚提取率的影響。

1.3.5 超聲次數(shù)對(duì)提取率的影響

在超聲溫度為30 ℃、料液比為1∶50、乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、超聲時(shí)間為30 min的條件下，將超聲次數(shù)分別設(shè)定為1、2、3、4、5次，探索超聲次數(shù)對(duì)黃精總酚提取率的影響。

1.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)中心復(fù)合設(shè)計(jì)原理，結(jié)合上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，以黃精總酚提取率為響應(yīng)值Y(%)，選取提取溫度(X1)、超聲次數(shù)(X2)、超聲時(shí)間(X3)這3個(gè)影響黃精總酚提取率的主要因素，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，開展3因素3水平的響應(yīng)面分析。各因素3個(gè)水平的設(shè)計(jì)值如下:X1，30 ℃(-1，代表水平，下同)，40 ℃(0)，50 ℃(1)；X2，2次(-1)，3次(0)，4次(1)；X3，20 min(-1)，30 min(0)，40 min(1)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)提取率的影響

由圖1可知，隨著料液比增加，黃精總酚提取率先逐漸增大，當(dāng)料液比為1∶50時(shí)黃精總酚提取率達(dá)到最大值，隨后黃精總酚的提取率呈下降趨勢。因此，選擇料液比為1∶50。

圖1 料液比對(duì)黃精總酚提取率的影響

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響

由圖2可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)由40%增長到70%時(shí)，黃精總酚的提取率逐漸升高，且在乙醇體積分?jǐn)?shù)在40%～50%和60%～70%的區(qū)間內(nèi)黃精總酚提取率增長較快，而在50%～60%區(qū)間增長較為平緩，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)黃精總酚提取率達(dá)到最高值。主要原因是，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%～60%時(shí)，提取物表面會(huì)出現(xiàn)一層無色透明物質(zhì)，該物質(zhì)隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而逐漸減少，至70%時(shí)無該物質(zhì)。該物質(zhì)疑似多糖，阻隔了乙醇與黃精藥材的接觸，影響了黃精總酚的提取。生產(chǎn)過程中同樣會(huì)遇到此問題。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)一步增大到80%～90%時(shí)，黃精總酚提取率逐漸下降。這可能與黃精總酚在不同體積分?jǐn)?shù)乙醇中的溶解度有關(guān)。綜上，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃精總酚提取率的影響

2.1.3 提取溫度對(duì)提取率的影響

由圖3可知:當(dāng)提取溫度為20～30 ℃時(shí)，黃精總酚的提取率較高，且呈上升趨勢；當(dāng)提取溫度為30～50 ℃時(shí)，黃精總酚的提取率明顯下降；當(dāng)提取溫度進(jìn)一步增加到60 ℃時(shí)，黃精總酚的提取率較50 ℃時(shí)上升。綜上，選擇提取溫度為30 ℃。

圖3 提取溫度對(duì)黃精總酚提取率的影響

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響

由圖4可知:當(dāng)超聲時(shí)間為20～30 min時(shí)，黃精總酚提取率隨超聲時(shí)間延長而升高，當(dāng)超聲時(shí)間為30 min時(shí)，黃精總酚提取率最高；當(dāng)超聲時(shí)間升至40 min時(shí)，黃精總酚提取率大幅下降；當(dāng)超聲時(shí)間延長至50～60 min時(shí)，黃精總酚提取率有所回升，但仍低于超聲時(shí)間為20～30 min時(shí)的黃精總酚提取率。綜上，選擇超聲時(shí)間為30 min。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)黃精總酚提取率的影響

2.1.5 超聲次數(shù)對(duì)提取率的影響

由圖5可知:當(dāng)超聲次數(shù)由1次增至3次的過程中，黃精總酚提取率相應(yīng)增高；當(dāng)超聲次數(shù)進(jìn)一步增加至4～5次時(shí)，黃精總酚的提取率并未能進(jìn)一步增加。可能是因?yàn)楫?dāng)超聲次數(shù)過多時(shí)，試驗(yàn)過程中產(chǎn)生的損耗愈明顯，造成黃精總酚提取率下降。綜上，選擇超聲次數(shù)為3次。

圖5 超聲次數(shù)比對(duì)黃精總酚提取率的影響

2.2 黃精總酚提取工藝優(yōu)化

根據(jù)Design-Export 8.0軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果詳見表1。

表1 黃精總酚提取的響應(yīng)面分析方案和結(jié)果

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行回歸擬合:

對(duì)擬合的模型進(jìn)行回歸分析，結(jié)果顯示，模型達(dá)極顯著水平，沒有失擬度，決定系數(shù)R2=0.996 4，調(diào)整值為0.991 7，擬合度較高，預(yù)測值與實(shí)際值具有較高的相似度，變異系數(shù)為2.15%。以上結(jié)果說明，用該響應(yīng)面模型來預(yù)測和優(yōu)化黃精總酚的提取工藝具備可行性。從回歸系數(shù)的檢驗(yàn)值可以看出，各因子對(duì)黃精總酚提取率的影響從高到低依次為提取溫度(X1)>超聲次數(shù)(X2)>超聲時(shí)間(X3)，其中，提取溫度的影響達(dá)到極顯著水平。

響應(yīng)曲面圖可以直觀地表示各個(gè)試驗(yàn)因素不同水平與響應(yīng)值的函數(shù)關(guān)系，比較直觀地反映不同因素間的交互關(guān)系。等值線圖越圓，表明兩因素的交互影響越小；等值線圖越扁，表明兩因素的交互影響越大。由圖6～8可知，提取溫度與超聲次數(shù)的斜面最陡，等線圖較扁，具有最高點(diǎn)，說明兩者交互作用最大；提取溫度與超聲時(shí)間的交互作用次之，其斜面較陡，底部等高線呈橢圓、閉合，有最高點(diǎn)，交互作用明顯；超聲次數(shù)與超聲時(shí)間的斜面較緩和，但等值線圖最扁，且有最高點(diǎn)，說明這兩者有較大的交互作用。

圖6 提取溫度與超聲次數(shù)對(duì)黃精總酚提取率的影響

圖7 提取溫度與超聲時(shí)間對(duì)黃精總酚提取率的影響

圖8 超聲次數(shù)與超聲時(shí)間對(duì)黃精總酚提取率的影響

通過軟件Design-Expert 8.0.6求解方程，得出最優(yōu)提取工藝條件:提取溫度為37.48 ℃，超聲次數(shù)為2.81 次，超聲時(shí)間為29.88 min，此時(shí)黃精總酚的提取率可達(dá)6.860 69 mg·g-1。

為提高黃精總酚的提取率，考慮到實(shí)際生產(chǎn)加工操作和節(jié)能需求，將黃精總酚的提取工藝條件優(yōu)化為提取溫度37 ℃、超聲次數(shù)3次、超聲時(shí)間30 min。經(jīng)3次重復(fù)驗(yàn)證，此條件下黃精總酚的提取率為7.003 35 mg·g-1，與理論預(yù)測值基本吻合，比單因素試驗(yàn)下的最高提取率高出0.399 mg·g-1。

3 小結(jié)

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選出對(duì)黃精總酚提取率影響較大的3個(gè)因素，并通過Box-Benhnken響應(yīng)面法優(yōu)化了超聲輔助提取黃精總酚的工藝參數(shù):料液比為1∶50，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，提取溫度為37 ℃，超聲次數(shù)為3次，超聲時(shí)間為30 min。在此條件下，黃精總酚的提取率可達(dá)7.003 35 mg·g-1。