奶粉攝入改善慢性不可預(yù)知性應(yīng)激誘導(dǎo)的小鼠抑郁樣行為

黃佳琪，成杰，朱艷艷，張秉義，朱莎莎，李帆

（1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院西安710061；2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚病科西安710061；3.陜西省商洛市疾病預(yù)防控制中心，陜西商洛726000）

0 引 言

隨著現(xiàn)代化生活壓力的增大和節(jié)奏的加快，“抑郁”逐漸成為人們關(guān)注的焦點。抑郁情緒嚴(yán)重影響個人生活，并導(dǎo)致社會適應(yīng)障礙，甚至危害自身生命健康[1-2]。抑郁治療可從多方面展開，除常規(guī)的藥物治療外，也可通過飲食調(diào)節(jié)的方式來治療[3-4]。一些營養(yǎng)物質(zhì)可作為輔助治療抑郁癥的手段，與其含有特定維生素、礦物質(zhì)和其他化學(xué)成分有關(guān)。如食物中含有的多不飽和脂肪酸、氨基酸、維生素均可改善抑郁[5]。牛奶粉作為一種常見的營養(yǎng)物質(zhì)，富含多種氨基酸、不飽和脂肪酸等[6]，其中ω-3多不飽和脂肪酸可激活過氧化物酶增殖物激活受體（Peroxisome proliferator-activated receptorα，PPARα）。PPARα作為調(diào)控物質(zhì)代謝、細(xì)胞增殖、炎癥反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄激活因子，廣泛分布于大腦神經(jīng)元細(xì)胞、腦血管內(nèi)皮細(xì)胞，且與學(xué)習(xí)記憶、抑郁等行為學(xué)密切相關(guān)[7-9]。血紅素氧合酶（heme oxygenase-1，HO-1）是PPARα的下游靶基因[10-11]，可介導(dǎo)抗氧化和細(xì)胞保護(hù)作用，對腦神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)至關(guān)重要，是治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要靶點[12-15]。牛奶粉的攝入對抑郁癥是否具有緩解作用，與PPARα和HO-1的表達(dá)是否有關(guān)，目前還不明確。因此，本實驗通過慢性不可預(yù)知性應(yīng)激建立小鼠抑郁模型，探究奶粉攝入對小鼠抑郁樣行為的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑、儀器

雄性ICR小鼠40只（20-25 g）購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心，隨機分為空白對照組、抑郁模型組、抗抑郁藥物組和奶粉組，每組10只，實驗已獲得西安交通大學(xué)動物倫理委員會審批（No.XJTULAC2019-1259）。全脂奶粉購自天津伊利乳業(yè)有限責(zé)任公司；鹽酸氟西汀購自常州四藥制藥有限公司（10 mg/片，H 19980139）；鼠多克隆抗PPARα抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司（美國）；兔多克隆抗HO-1抗體購自Cell Signaling Technology公司（美國）；懸尾測試儀（TST-100）購自成都泰盟軟件有限公司。

1.2 慢性不可預(yù)知性應(yīng)激模型

實驗采用的慢性不可預(yù)知性應(yīng)激包括4℃冰水游泳（3 min）、禁食（12 h）、傾斜鼠籠（12 h）、夾尾（5 min）、慢性束縛（1 h），多種應(yīng)激隨機安排，每天1種，同種應(yīng)激不連續(xù)出現(xiàn)，持續(xù)6周。

1.3 動物模型驗證

施加慢性不可預(yù)知性應(yīng)激4周后，利用懸尾測試儀進(jìn)行懸尾實驗（tail suspension test，TST），檢測小鼠抑郁模型。

1.4 模型處理

奶粉組小鼠每晚20點給予現(xiàn)配牛奶粉（12.5 g全脂奶粉溶于90 mL水），次日早晨8點將奶粉乳液換為飲用水，持續(xù)2周；同時對藥物組小鼠進(jìn)行鹽酸氟西汀灌胃，灌胃劑量為5 mg/(kg·d-1)，持續(xù)2周。

1.5 Western Blot檢測

取小鼠海馬組織，提取蛋白裂解液，蛋白樣品在10%SDS-PAGE膠中分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉后孵育一抗和二抗，ECL化學(xué)發(fā)光，采用Image J軟件進(jìn)行灰度值測定。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。統(tǒng)計學(xué)分析采用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計學(xué)軟件，多組間比較采用one-way ANOVA進(jìn)行分析，P＜0.05為統(tǒng)計學(xué)有差異。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠體質(zhì)量與攝食量變化

慢性不可預(yù)知性應(yīng)激在一定程度上可影響小鼠體質(zhì)量與攝食[16]。如圖1（a）所示，實驗第4周，對照組小鼠體重顯著高于施加慢性不可預(yù)知性應(yīng)激小鼠的體重（P＜0.05），再給予藥物和奶粉2周干預(yù)后，藥物組和奶粉組小鼠體重回升，且與對照組無顯著差異，而模型組小鼠體重與對照組仍有顯著差異（P＜0.05）。圖1（b）顯示，慢性不可預(yù)知性應(yīng)激降低小鼠攝食量，給予藥物干預(yù)后，藥物組小鼠攝食量增加，與對照組無顯著差異，給予奶粉干預(yù)后，奶粉組小鼠攝食量顯著降低（P＜0.05）。奶粉組小鼠常規(guī)飼料攝入減少可能與攝入奶粉乳液后小鼠飲食結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量與攝食量變化情況

2.2 抑郁模型驗證

給予小鼠慢性不可預(yù)知性應(yīng)激4周后，利用懸尾實驗檢測小鼠抑郁樣行為。如圖2所示，模型組、藥物組、奶粉組小鼠在懸尾實驗中不動時間顯著性高于空白對照組（P＜0.05），提示慢性不可預(yù)知性應(yīng)激可誘導(dǎo)出了小鼠抑郁樣行為，抑郁模型建立。

圖2 小鼠懸尾實驗檢測結(jié)果

2.3 奶粉攝入改善小鼠抑郁樣行為

給予小鼠藥物或奶粉乳液2周后，利用懸尾實驗檢測小鼠抑郁樣行為。如圖3所示，模型組小鼠不動時間仍顯著高于空白對照組（P＜0.05），表明小鼠抑郁樣行為仍然存在。與模型組相比，藥物組與奶粉組小鼠懸尾不動時間降低，且有顯著性差異（P＜0.05）。表明抗抑郁藥物可有效改善小鼠抑郁情況，攝入奶粉乳液也可緩解小鼠抑郁樣行為。

圖3 小鼠懸尾實驗檢測

2.4 奶粉攝入對小鼠海馬體形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

對照組小鼠海馬組織CA1區(qū)的椎體細(xì)胞排列層數(shù)較多且整齊，模型組椎體細(xì)胞較對照組排列散亂。藥物組與奶粉組CA1區(qū)的椎體細(xì)胞形態(tài)與對照組無明顯差異，提示奶粉干預(yù)對小鼠海馬組織CA1區(qū)椎體細(xì)胞形態(tài)有保護(hù)作用。

圖4 小鼠海馬體CA1區(qū)HE染色

2.5 奶粉攝入逆轉(zhuǎn)小鼠海馬體PPARα及HO-1蛋白表達(dá)

PPARα和HO-1是影響大腦神經(jīng)系統(tǒng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，如圖5所示，慢性不可預(yù)知性應(yīng)激降低小鼠海馬體PPARα和HO-1的蛋白表達(dá)水平，給予小鼠藥物或奶粉乳液干預(yù)后，PPARα和HO-1的蛋白表達(dá)水平可被逆轉(zhuǎn)。

圖5 奶粉攝入逆轉(zhuǎn)小鼠海馬PPARα及HO-1蛋白水平

3 討 論

抑郁的發(fā)生與腦組織病變密不可分，通過飲食來調(diào)節(jié)或治療抑郁已經(jīng)成為人們關(guān)注的熱點。從飲食結(jié)構(gòu)角度而言，不良的飲食結(jié)構(gòu)是多數(shù)抑郁焦慮患者共有的特征，表現(xiàn)為優(yōu)質(zhì)蛋白和膽固醇等營養(yǎng)成分?jǐn)z入不足[17-18]。在本實驗中，由于奶粉乳液的攝入，小鼠的常規(guī)攝食量減少，但體重呈回升趨勢，小鼠飲食結(jié)構(gòu)的調(diào)整使更多的優(yōu)質(zhì)蛋白被攝入，對小鼠抑郁樣行為的緩解有促進(jìn)作用。奶粉中營養(yǎng)物質(zhì)豐富，有研究顯示牛奶酪蛋白水解肽可以通過血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，對神經(jīng)元發(fā)揮保護(hù)作用[19-20]。牛奶中豐富的α-乳白蛋白具有舒緩壓力、促進(jìn)睡眠的作用[21]，而牛奶中的L-色氨酸可用于合成5-HT與褪黑素，促進(jìn)睡眠[22]，這些都可能是潛在的改善抑郁樣行為的營養(yǎng)物質(zhì)。實驗中用到的抗抑郁藥物鹽酸氟西汀可明顯改善小鼠的抑郁樣行為，研究表明該藥物主要通過PPARα的表達(dá)與激活發(fā)揮作用[23]。在本實驗中，慢性不可預(yù)知性應(yīng)激降低了小鼠海馬區(qū)域PPARα和HO-1的蛋白表達(dá)水平，奶粉攝入逆轉(zhuǎn)小鼠海馬組織PPARα和HO-1表達(dá)水平，可能是奶粉緩解抑郁樣行為的重要機制。此外，由于奶粉富含的乳蛋白與乳脂，相對于普通飲用水，其口感更佳，小鼠更偏好奶粉乳液，攝食過程中的愉悅心理以及應(yīng)激后的食物獎賞機制也是改善抑郁的可能因素[24-25]。

綜上所述，本研究闡釋了奶粉攝入緩解慢性不可預(yù)知性應(yīng)激誘導(dǎo)的小鼠抑郁樣行為，可能與小鼠的飲食結(jié)構(gòu)改變及大腦海馬體PPARα、HO-1蛋白表達(dá)水平有關(guān)。本研究可為富含營養(yǎng)物質(zhì)的奶粉治療抑郁提供新的理論依據(jù)。