北京市某院難辨梭菌臨床分離株耐藥性及毒素基因攜帶情況分析

邵冬華，宋 燕，梁國威

（航天中心醫院檢驗科，北京 100049）

難辨梭菌感染目前已經成為院內感染的主要威脅之一，在一些特定區域甚至超過耐甲氧西林金黃色葡萄球菌而成為院感防控最棘手的問題[1]。難辨梭菌的致病性與其產生的2種致病毒素有關。A毒素（Clostridium difficiletoxin A，TcdA）為腸毒素，能趨化中性粒細胞浸潤回腸壁釋放細胞因子，導致液體大量分泌和腸壁出血壞死；B毒素（Clostridium difficiletoxin B，TcdB）為細胞毒素，能使肌動蛋白解聚，損壞細胞骨架，致細胞團縮壞死，能直接損傷腸壁細胞。臨床致病菌株以攜帶A、B 2種毒素基因（即A+B+菌株）多見，A毒素也一直被認為是難辨梭菌引起腹瀉的主要致病因素。近年來的研究發現，臨床分離的部分菌株編碼A毒素的基因tcdA常出現110 bp的缺失，這種攜帶缺失的tcdA基因的菌株，即A-B+菌株，在歐洲及亞洲的一些國家相繼出現，同樣可以引起腹瀉，甚至引發偽膜性腸炎[2]。航天中心醫院相關性腹瀉（Clostridium difficile-associated diarrhea，CDAD）的既往治療用藥物主要為甲硝唑和萬古霉素。但近年來難辨梭菌對甲硝唑和萬古霉素的敏感性呈逐年降低的趨勢，因此監測難辨梭菌對常用抗菌藥物的敏感性非常重要。本研究對航天中心醫院難辨梭菌的耐藥性及致病菌株攜帶A、B毒素情況進行初步分析，以期為臨床治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

收集2015年3月—2016年5月航天中心醫院住院期間出現不明原因腹瀉患者的糞便樣本335例。

1.2 主要試劑和儀器

MASTER MIX [天根生化科技（北京）有限公司]，ABI 7500實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司），厭氧菌培養系統（荷蘭ANOXOMAT公司），質譜儀及難辨梭菌鑒定培養基（chromIDClostridium difficileagar，CDIF）（法國生物梅里埃公司），厭氧血平板（天津金章公司），阿莫西林、甲硝唑、克林霉素、萬古霉素、莫西沙星、氨芐西林-舒巴坦、美羅培南藥物敏感性試驗紙條（鄭州安圖公司），難辨梭菌標準菌株（ATCC 9689）由中日友好醫院贈送。

1.3 方法

1.3.1 樣本處理 取糞便樣本180～220 mg，置于2 mL離心管中。按試劑說明書要求加入500 μL SA緩沖液、100 μL SC緩沖液、15 μL Proteinase K，間歇振蕩1 min至樣本充分混勻。95 ℃孵育15 min，孵育過程中震蕩2～3次，渦旋震蕩15 s，再13 400×g離心3 min，分離上清液至新的離心管中，加入10 μL RNase A，震蕩混勻后室溫放置5 min。加入200 μL SH緩沖液，震蕩混勻，13 400×g離心3 min，收集上清液，置于0.5 mL Eppendorf管中，-20 ℃保存備用。

1.3.2 糞便樣本tpi及A、B毒素基因檢測 參照文獻[3]，采用TaqMan-MGB探針實時熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測難辨梭菌tpi基因及A、B毒素基因。反應體系均為20 μL，其中細菌基因組DNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，TaqMan-MGB探針1 μL。反應條件：95 °C 2 min，95°C 15 s，57 °C 1 min，40個循環。引物序列見表1。

表1 難辨梭菌tpi、tcdA、tcdB、tcdAT引物及探針序列

1.3.3 難辨梭菌培養及鑒定 在難辨梭菌tpi基因陽性的糞便樣本中加入等體積無水乙醇，充分混勻后室溫放置30 min。用接種環蘸取預處理過的糞便接種于CDIF，厭氧培養48 h，以培養基上呈現典型的灰色或黑色菌落為可疑菌落。采用質譜儀進一步驗證可疑菌落，以確保鑒定結果準確無誤。挑取確定為難辨梭菌的單個菌落接種于厭氧血平板進行傳代，通過分離純化獲得更多的高純度難辨梭菌菌株。

1.3.4 體外藥物敏感性試驗 根據美國臨床實驗室標準化協會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2016年標準，采用E試驗進行藥物敏感性試驗。

1.3.5 患者一般情況比較 比較檢出A+B+菌株和A-B+菌株的患者的病史、臨床用藥史、實驗室檢測結果是否存在差異。

1.4 統計學方法

采用SPSS 13.0軟件進行統計分析。呈正態分布的數據以±s表示，非正態分布數據經對數轉換為正態分布，組間比較采用獨立樣本t檢驗。計數資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 糞便樣本tpi基因及A、B毒素基因檢測結果

335例糞便樣本中，56例檢出tpi基因（16.7%）。其中10例（17.9%）檢出A-B+菌株，46例（82.1%）檢出A+B+菌株。tpi基因陽性菌株病區來源見圖1。

圖1 tpi基因陽性菌株病區來源

2.2 細菌鑒定及體外藥物敏感性試驗結果

56株tpi基因陽性菌株經質譜儀鑒定，均確定為難辨梭菌，其耐藥性見表2、表3。

2.3 A+B+菌株和A-B+菌株感染患者臨床特征比較

46例檢出A+B+菌株的患者年齡（76.1±14.3）歲，其中男27例（58.6%），年齡（75.7±15.4）歲；10例檢出A-B+菌株的患者中，男7例（70.0%），年齡（78.6±6.8）歲。檢出A+B+菌株和A-B+菌株男性患者所占比例及年齡比較無差異（P＞0.05）。檢出2種菌株的患者既往病史、臨床用藥史、常規實驗室檢測指標比較無差異（P＞0.05），見表4～表6。

表2 56株tpi陽性難辨梭菌對7種抗菌藥物的耐藥率

表3 多重耐藥菌株耐藥模式

表4 檢出2種菌株的患者既往病史比較 例（%）

表5 檢出2種菌株的患者臨床用藥史比較 例（%）

表6 檢出2種菌株患者實驗室檢測指標比較 ±s

表6 檢出2種菌株患者實驗室檢測指標比較 ±s

注：*表示對原始數據進行對數轉換后的數據值

淋巴細胞/中性粒細胞比值菌株 白細胞計數/（×109/L）中性粒細胞百分比/%淋巴細胞百分比/%C反應蛋白/（mg/L）血肌酐/（mmol/L）白蛋白/（g/L）A+B+菌株 2.21±0.54* 73.35±11.72 17.65±9.08 3.05±0.70* 3.17±0.95* 4.05±0.44* 31.43±5.23 A-B+菌株 2.30±0.35* 74.03±12.11 17.56±12.1 2.94±0.92* 3.77±1.05* 4.28±1.06* 31.72±5.24 P值 0.615 0.868 0.980 0.648 0.101 0.269 0.875

3 討論

2017年，美國感染病協會和美國醫療保健流行病學學會推薦采用核酸擴增方法診斷難辨梭菌感染[4]。本研究采用TaqMan-MGB探針實時熒光定量PCR對335例臨床不明原因腹瀉患者的糞便樣本進行快速篩查。該方法直接提取糞便DNA檢測難辨梭菌菌屬tpi基因及毒素基因。由于tpi的編碼基因是難辨梭菌的管家基因，具有種的特異性，是難辨梭菌區別于其他細菌的特異性基因，可應用于臨床樣本中難辨梭菌的快速篩選檢測[5]。本研究335例糞便樣本中有56例檢出難辨梭菌，其中10株（17.9%）A-B+菌，46株（82.1%）A+B+菌。A-B+菌株的分離率存在著地區差異，在歐洲及北美地區的分離率為0.2%～8.0%[6]，韓國和泰國的分離率曾達到40%[7-8]。A、B毒素在致病性方面也存在爭議，A毒素曾被認為是引起腹瀉的主要原因，B毒素在艱難梭菌致病性方面起至關重要的作用，不同地區2種菌株所致疾病的嚴重程度和臨床特征也不盡相同。A-B+菌株既可以無癥狀定植，也可以引起偽膜性腸炎，A-B+菌株比A+B+菌株更易引起偽膜性腸炎[9]。本研究56例患者的年齡、性別、既往病史、臨床用藥史以及實驗室檢測結果差異均無統計學意義（P＞0.05），與KIM等[10]的研究結果一致。

近年來，難辨梭菌對甲硝唑和萬古霉素的敏感性呈逐年降低趨勢，并出現了耐藥菌株。2011—2013年，美國難辨梭菌對萬古霉素的耐藥率為13.2%[11]，巴西和以色列難辨梭菌對萬古霉素的耐藥率分別為58.0%和31.5%[12-13]。本研究中，56株難辨梭菌對甲硝唑耐藥的有6株（10.7%），未發現對萬古霉素耐藥菌株，但有6株難辨梭菌表現出對萬古霉素耐藥性下降的特征，其中2株對甲硝唑耐藥的同時，對萬古霉素的敏感性下降，提示難辨梭菌對2種臨床首選抗菌藥物的耐藥性增高甚至耐藥。

本研究結果顯示，艱難梭菌對克林霉素的耐藥率達到75.0%，對莫西沙星的耐藥率為57.1%?？肆置顾睾湍魃承请p重耐藥比例占耐藥菌株的51.8%，三重耐藥菌株占8.9%。難辨梭菌多重耐藥模式的出現也說明其耐藥形勢嚴峻。有學者發現克林霉素的過量使用是A-B+菌株感染的獨立危險因素[10]。本研究56例患者均未使用過克林霉素，但對克林霉素的耐藥率卻達75.0%。在沒有藥物選擇性壓力存在的情況下，是什么原因導致的細菌耐藥需要進一步研究。本研究56例感染難辨梭菌的患者年齡為（76.1±14.3）歲，其中約77%的患者來自于老年科、消化科及呼吸科，提示免疫功能下降、高齡、患有嚴重基礎疾病的患者易受難辨梭菌毒素攻擊。

綜上所述，航天中心醫院難辨梭菌臨床分離株耐藥形勢嚴峻，多重耐藥模式多見，A+B+菌株和A-B+菌株感染患者的臨床特征無差異。