干熱法滅活對新型冠狀病毒肺炎相關炎癥指標檢測的影響

趙明海，李 欣，魏 東，羅 敏，張雅潔，楊懿祺，鄭 磊

（南方醫科大學南方醫院檢驗科，廣東 廣州 510515）

由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2）感染引起的新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）已對我國及全世界人民的健康造成了巨大的威脅[1-3]。我國已將其納入《中華人民共和國傳染病防治法》規定的乙類傳染病，并按照甲類傳染病管理。SARSCoV-2的主要傳播途徑是經呼吸道飛沫傳播，亦可通過接觸傳播（手-口、糞-口），同時可能存在氣溶膠傳播[4]。目前，對于COVID-19的診斷、病情評估及監測主要根據各項實驗室檢測指標，其中檢測過程中的拔蓋步驟存在氣溶膠傳播的高風險[5]。拔蓋前對病毒滅活可有效降低其傳播風險，保護檢驗人員的安全。目前認為56 ℃ 30 min可對SARS-CoV-2進行滅活，已有報道56 ℃ 30 min滅活處理血液樣本對免疫層析法及化學發光免疫分析法SARS-CoV-2抗體檢測、咽拭子SARS-CoV-2核酸檢測結果無明顯影響[6-7]。由于COVID-19診療過程中涉及的實驗室檢查不僅包括核酸檢測、抗體檢測，其他實驗室指標也十分重要，其中炎癥標志物不僅對COVID-19的鑒別診斷意義重大，對COVID-19重癥患者的病情評估及用藥指導也十分重要。白細胞介素6（interleukin 6，IL-6）可以作為判斷疾病嚴重程度和預后的生物標志物[8]，C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）和降鈣素原（procalcitonin，PCT）可以作為鑒別診斷細菌、病毒感染的輔助指標[9-11]。白露等[12]發現炎癥細胞因子刺激和釋放治療會使相關指標水平升高，56 ℃ 30 min水浴法滅活對CRP和PCT的檢測結果無影響，對IL-6的檢測結果有影響。但該研究樣本量較小，且樣本采集是使用帶分離膠的試管，并從離心后的樣本中分離出1/2血清作為滅活后檢測的樣本，而臨床大部分實驗室是使用樣本采集管而非帶分離膠的試管，滅活是在樣本拔蓋前進行，凝集后紅細胞及分離血清在同一試管內。本研究擴大了樣本量，并通過模擬臨床實際進行滅活前處理，即收集臨床中已進行過CRP、PCT和IL-6檢測的樣本，蓋上帽蓋后立即進行滅活并再次檢測，進一步明確干熱法滅活對COVID-19診療常用炎癥指標的影響。

1 材料和方法

1.1 研究對象

隨機選取2020年3月2日—5月28日南方醫科大學南方醫院檢驗科進行過CRP、PCT和IL-6檢測，且結果盡量覆蓋線性范圍的無脂血、溶血的臨床剩余血樣本332例，其中CRP檢測樣本104例、PCT檢測樣本124例、IL-6檢測樣本104例。采集靜脈血后，2 191×g離心10 min，收集分離的血清進行檢測。本研究經南方醫科大學南方醫院倫理委員會審查通過（倫理號：NFEC-2018-144）。

1.2 儀器與試劑

靜脈血樣本采集管購自成都瑞奇科技實業有限責任公司。IL-6和PCT采用cobas e602全自動電化學法發光免疫分析儀（瑞士羅氏公司）及配套試劑（電化學發光雙抗體夾心法）檢測，CPR采用cobas e7500全自動生化分析儀（瑞士羅氏公司）及配套試劑（顆粒增強投射免疫比濁法）檢測。干熱滅活儀器為DHG-9203A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）。

1.3 方法

在當天室內質控合格的前提下，收集當天符合納入要求、已檢測CRP、PCT和IL-6且經過審核的剩余血樣本，蓋上帽蓋后放入干燥箱進行56 ℃ 30 min干熱滅活，使用經校準的溫度計分別在滅活前、后對干燥箱溫度進行監測。滅活后將帽蓋拔去，當天重新對樣本進行CRP、PCT和IL-6檢測，并記錄結果。

1.4 統計學方法

采用 SPSS 23.0軟件進行統計分析，采用SPSS 23.0及GraphPad Prism 8軟件進行繪圖。非正態分布的計量資料采用中位數（M）[四分位數（P25，P75）]表示，組間比較采用配對秩和檢驗。采用Spearman相關分析評估滅活前、后檢測結果的相關性，采用Bland-Altman法進行一致性分析，以≥95%的散點位于差值的95%可信區間內為有一致性。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 干熱法滅活對CRP、PCT及IL-6檢測結果的影響

與滅活前比較，332例樣本滅活后均未出現肉眼可見的溶血現象。CRP滅活前、后檢測結果差異無統計學意義（P=0.456），PCT、IL-6滅活前、后檢測結果差異有統計學意義（P＜0.001）；PCT經滅活后有98例樣本水平下降，其中5例超過參考區間的樣本滅活后檢測結果降至參考區間內（滅活前分別為0.050、0.053、0.056、0.058 及0.600 ng/mL，滅活后分別為0.040、0.046、0.049、0.047及0.042 ng/mL），1例處于醫學決定水平附近（0.5 ng/mL）的樣本經滅活后低于醫學決定水平（由0.503 ng/mL降為0.478 ng/mL）。見表1、圖1。

表1 滅活前、后3項炎癥指標檢測結果比較

圖1 滅活前、后散點圖

2.2 滅活前、后檢測結果的一致性和相關性

Bland-Altman圖分析結果顯示，PCT、CRP及IL-6分別有96.77%、97.11%及97.11%的散點位于差值的95%可信區間內，干熱法滅活前、后檢測結果結果具有一致性（相對偏移分別為0.431%、0.141%、2.133%），見圖2。滅活前、后PCT、CRP、和IL-6的檢測結果均呈正相關（r值分別為0.992、0.999、0.966，P＜0.05）。

圖2 熱滅活前、后一致性分析

3 討論

由SARS-CoV-2引起的疫情嚴重威脅著全世界人民的生命安全，盡管明確的接觸史、全身癥狀和肺炎的影像學改變可基本確定COVID-19，但實驗室檢測結果仍是COVID-19確診的金標準。由于SARS-CoV-2具有極強的傳染性，檢驗人員在處理各種樣本時面臨極大的感染風險。如何減少檢驗工作人員的感染風險，保證實驗室生物安全，引起了臨床實驗室的關注。目前認為SARS-CoV-2的傳播途徑除經呼吸道飛沫傳播、接觸傳播外，還可能存在氣溶膠傳播，特別是在相對封閉的實驗室中長時間暴露于高濃度氣溶膠時，感染風險有可能增加[14]。盡管《新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術指南（第二版）》[15]要求未經滅活的COVID-19患者相關臨床樣本的血清學檢測應在生物安全二級實驗室進行，同時采用生物安全三級實驗室的個人防護，但也不能完全保證檢驗人員的安全。

目前，學者們認為SARS-CoV-2對紫外線和熱敏感，56 ℃ 30 min、乙醚、75%乙醇、含氯消毒劑、過氧乙酸和氯仿等脂溶劑均可對其有效滅活[4]。因此，在樣本開蓋之前對其進行滅活可有效減少檢驗工作人員操作風險。本研究結果顯示，56 ℃ 30 min滅活后，261例樣本并未出現肉眼可見的溶血現象，滅活對CRP的檢測結果無影響，對PCT、IL-6有影響，與劉兆宇等[13]報道的加熱滅活對PCT檢測結果無影響的結論不一致。本研究124例PCT樣本經滅活處理后，有98例水平下降，其中5例超過參考區間的樣本滅活后檢測結果降至參考區間內。有研究結果表明，在樣本采集24 h后，PCT水平在室溫下大約下降12%，4 ℃條件下大約下降6%[16]。由此可見，加熱滅活可能會加快PCT水平的下降。此外，PCT、IL-6、CRP滅活前、后檢測結果的一致性及相關性顯著。因此，臨床上可考慮使用不帶分離膠的常規采血管對CRP進行滅活處理，但對PCT及IL-6進行滅活需慎重。值得注意的是，由于PCT滅活后結果存在下降趨勢，對于處于參考區間臨界值及醫學決定水平附近的結果需要謹慎處理。

相較已有的研究報道，本研究從臨床更為常見的情境出發，包括使用臨床上多采用的不帶分離膠的采血管，離心后凝集的紅細胞和血清在同一試管內等情況，對COVID-19診療中用于檢測3項炎癥指標的樣本進行滅活處理，評估其操作可行性。本研究也存在一些局限性：（1）本研究只是提供策略參考，受不同儀器及檢測原理的影響，不同實驗室需根據自身條件評估滅活對檢測結果的影響；（2）大多臨床實驗室CRP與血常規合并使用乙二胺四乙酸抗凝管、全血模式檢測，尤其在發熱門診，但由于本實驗室尚未開展此類檢測，因此該類樣本滅活方式及檢測結果一致性需進一步驗證。

本研究通過模擬臨床常見滅活前處理流程，發現56 ℃ 30 min干熱滅活對CRP檢測結果無影響，對PCT、IL-6檢測結果有影響。本研究結果可為擬通過加熱滅活減少實驗室SARS-CoV-2檢測樣本傳染性風險的前處理流程提供可行性參考，在防護物資有限的情況下，干熱法滅活可有效降低感染風險，保證檢測人員安全。