SARS-CoV-2、HCoV-OC43和HCoV-HKU1棘突蛋白抗原表位分析

曾建濤，李 泉，周麗莉，董姍姍，鄭兆斌

（1.重慶市長壽區人民醫院醫學檢驗科，重慶 401220；2.重慶市長壽區人民醫院心內科，重慶 401220）

引發新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）疫情的嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）的結構與2003年發現的嚴重急性呼吸綜合癥冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome-related coronavirus，SARSr-CoV）有很大的相似性[1]，但與其他毒力較弱的冠狀病毒，如人冠狀病毒（human coronavirus，HCoV）-OC43、HCoVHKU1在進化樹上有較大的距離[2]。有研究結果顯示，所有人群都對SARS-CoV-2易感，但由SARS-CoV-2感染引發的COVID-19在兒童中的發病率低于成人，并且整體上臨床癥狀較輕[3]。本研究擬通過SARS-CoV-2與另外2種流行的冠狀病毒（HCoV-OC43、HCoV-HKU1）棘突（spike，S）蛋白抗原表位的比較，探討低毒性冠狀病毒是否對SARS-CoV-2有交叉保護作用。

1 材料和方法

1.1 3種冠狀病毒S蛋白氨基酸序列及空間結構的來源

SARS-CoV-2、HCoV-OC43和HCoV-HKU1的S蛋白氨基酸序列及S蛋白空間結構均從美國國立生物技術信息中心（the National Center for Biotechnology Information，NCBI）數據庫中下載。

1.2 氨基酸序列比對

采用全局比對軟件MAFFT進行多氨基酸序列的比對。

1.3 B細胞抗原表位的預測

B細胞抗原表位采用Protean軟件及在線IEDB軟件進行計算。線性B細胞抗原表位使用IEDB軟件的BebiPred 2.0算法，臨界值設置為0.55，設定7個以上連續的氨基酸。BebiPred計算的結果與Protean軟件的Plot-Kyte-Doolittle親水性參數、Plot-Emini表面可及性參數、Jameson-Wolf抗原指數3個參數一起綜合分析。構象B細胞表位使用IEDB軟件的Discotope 2.0算法，臨界值設置為-2.5。

1.4 T細胞抗原表位的預測

T細胞抗原表位采用IEDB軟件的MHC-Ⅰ Binding Predictions算法及SYFPEITHI數據庫Epitope prediction算法進行預測[4]，氨基酸殘基長度定義為默認設置，等位基因選擇主要組織相容性復合物（major histocompatibility complex，MHC） -Ⅰ類HLA-A*02.01。

2 結果

2.1 3種冠狀病毒S蛋白的氨基酸序列及空間結構數據

選取NCBI數據庫中收錄的65條完整的SARS-CoV-2 S蛋白序列，多序列比對后選取9條S蛋白無氨基酸重復的序列。系統進化樹以QHZ87592.1為標準序列，其他8條S蛋白序列共出現8個位點的突變和1個位點的缺失。突變位點分別為R408I、F157L、H49Y、Y28N、A930V、S247R、S221W和F797C，1個位點缺失為Y144缺失。這些突變和缺失均未分布在受體結合域（receptor binding domain，RBD）區域，對S蛋白與血管緊張素轉換酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）的結合無影響。分別選取AIX10763.1和AYN64561.1作為HCoVOC43和HCoV-HKU1的S蛋白序列。3種冠狀病毒S蛋白基本特征見表1。

表1 3種冠狀病毒S蛋白基本特征

2.2 氨基酸多序列比對結果

在SARS-CoV-2 S蛋白的RBD區域，序列比對顯示有較大的缺口，提示這部分區域3種冠狀病毒S蛋白氨基酸相似度較低，SARS-CoV-2與HCoV-OC43、HCoV-HKU1的RBD區域有明顯差異。在S2亞基的部分區域，SARS-CoV-2與HCoV-OC43、HCoV-HKU1的氨基酸序列相似性較高。3條S蛋白多序列比對結果見圖1、圖2。

2.3 SARS-CoV-2、HCoV-OC43和HCoV-HKU1的S蛋白B細胞抗原表位比較

SARS-CoV-2、HCoV-OC43和HCoV-HKU1的S蛋白B細胞抗原表位主要集中在S1亞基，選取打分值最高的5個B細胞抗原表位，相互之間無相似性。見表2。

圖1 SARS-CoV-2與HCoV-OC43、HCoV-HKU1的RBD區域氨基酸比對圖

圖2 SARS-CoV-2與HCoV-OC43、HCoV-HKU1的S2亞基部分區域氨基酸比對圖

表2 預測的3種冠狀病毒S蛋白B細胞抗原表位

2.4 SARS-CoV-2、HCoV-OC43和HCoV-HKU1的S蛋白T細胞抗原表位比較

采用2種方法預測SARS-CoV-2、HCoV-OC43和HCoV-HKU1的S2亞基區域，選取打分值最高的5個T細胞抗原表位，氨基酸序列和啟止位點見表3。序列位點的比對見圖2。HCoV-HKU1、HCoVOC43的S2亞基T細胞抗原表位與SARS-CoV-2比較，均有一定的相似性，最高相似度為70.0%。

表3 預測的3種冠狀病毒S蛋白T細胞抗原表位相似度

3 討論

冠狀病毒分布廣泛，是一種常見的可感染人類、禽類等脊椎動物，引起呼吸道疾病和腸道疾病的病原體。2012年國際病毒分類命名委員會根據其遺傳學差異和血清學特性將冠狀病毒分為α、β、γ、δ 4個群。目前已發現了7種對人類致病的冠狀病毒，包括HCoV-OC43、HCoV-HKU1、HCoV-229E、HCoV-NL63、SARS-CoV、中東呼吸綜合征冠狀病毒（middle east respiratory syndrome-related coronavirus，MERSr-CoV）和SARS-CoV-2。β群冠狀病毒包括SARS-CoV、SARS-CoV-2、HCoV-OC43和HCoV-HKU1等。

S蛋白是冠狀病毒的重要蛋白，屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白，包含2個結構域：受體結合亞基S1和膜融合亞基S2，分別在識別細胞受體及與細胞融合的過程中發揮重要作用。本研究結果顯示，SARS-CoV-2與HCoV-OC43、HCoV-HKU1受體結合區域的氨基酸明顯不同，表明SARSCoV-2與其他2種病毒識別的細胞受體不同。在公布的SARS-CoV-2氨基酸序列中，突變和缺失位點均不在RBD區域，因此突變對SARS-CoV-2 S蛋白與易感細胞ACE2的結合無影響。

冠狀病毒通過S蛋白與易感細胞表面受體結合后，入侵細胞，造成感染，同時誘發機體的免疫應答。本研究結果顯示，S蛋白包含多種抗原表位，可能在誘導細胞免疫和體液免疫中有重要作用。體液免疫是以效應B細胞產生抗體發揮免疫作用。B淋巴細胞表面的抗原受體與病毒的B細胞抗原表位相結合后，刺激特異的B淋巴細胞克隆增殖，產生相應的抗體。本研究結果顯示，3種冠狀病毒的B細胞抗原表位主要集中在S1亞基，但相互間無相似性，提示3種冠狀病毒S蛋白抗原刺激B淋巴細胞產生的抗體可能無交叉反應性。

細胞免疫主要由T淋巴細胞介導。細胞毒性T細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）在抗病毒感染中起著重要作用。人CTL細胞的特征性表型為CD8+T細胞。CTL通過T細胞受體（T cell receptor，TCR）識別MHC-Ⅰ類分子提呈的抗原肽，通過穿孔素、顆粒酶和FasL途徑引起DNA斷裂及靶細胞凋亡，特異性殺傷被特定病毒感染的靶細胞。在對抗原應答的后期，絕大多數效應T細胞發生凋亡，少數T細胞分化成記憶性T細胞，介導再次免疫應答。

傳統的免疫學觀點為“1種克隆型只有1種特異性”，但最近的研究結果表明TCR-肽-MHC之間的相互作用并不是嚴格保守的，在結合規則內有相當大的靈活性[5]，這為T細胞的交叉免疫提供了可能性。有研究結果顯示，一種T細胞克隆可以通過相似的抗原肽段靶向多種感染，這被稱為異源免疫[6]，如暴露過流感病毒的人群可以對新型H7N9 流感病毒產生免疫保護[7]。

GUAN等[8]分析了1 011例SARS-CoV-2感染患者，＜14歲的患者僅占0.9%，占重癥患者的比例為0.6%。有研究結果顯示，HCoV-OC43和HCoV-HKU1常在冬春季節流行，造成呼吸道感染[9]，雖然各年齡組均可發生感染，但兒童的陽性率高于成人[10]，這表明兒童更易被HCoVOC43、HCoV-HKU1等低毒性冠狀病毒感染。MHC-Ⅰ類分子結合由8～10個氨基酸組成的肽。本研究結果顯示，3種冠狀病毒S2亞基的T細胞抗原表位肽有一定的相似性，最高相似度可達70.0%。這些抗原表位可能是3種冠狀病毒的共同抗原，HCoV-OC43和HCoV-HKU1致敏的記憶T淋巴細胞可能對SARS-CoV-2感染有交叉保護作用。

綜上所述，SARS-CoV-2、HCoV-OC43和HCoV-HKU1的S蛋白RBD區域有較大的差異，S蛋白的B細胞抗原表位無相似性，但S蛋白S2亞基的T細胞抗原表位有較高的相似度，最高相似度為70.0%，這對于SARS-CoV-2疫苗的研制有一定的價值。