載脂蛋白M在非小細胞肺癌A549細胞增殖、遷移和侵襲中的作用

王子謹，張曉膺

（蘇州大學附屬第三醫學院心胸外科，江蘇 常州 213003）

目前，人類所有癌癥中以肺癌的發病率最高，2018年全球新增肺癌病例占所有癌癥的11.6%[1]。肺癌也是死亡率最高的癌癥，2018年全球肺癌患者死亡例數占全部死亡例數的18.4%[2]。肺癌分為2種組織學亞型：小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）。NSCLC約占所有肺癌的85%，是最主要的肺癌亞型。深入研究肺癌的發生、發展，探尋新的獨立標志物對肺癌的診療有重大意義。載脂蛋白M（apolipoprotein M，apo M）是1999年被XU等[3]從乳糜微粒中分離并克隆的一種新型載脂蛋白。近年來，有許多研究結果顯示，載脂蛋白家族參與了多種腫瘤的發生、發展及預后[4-6]。為此，apo M對NSCLC發生、發展的影響值得進一步研究。另外，基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）家族與肺癌的增殖、侵襲及轉移相關[7]，其中MMP-3、MMP-10、MMP-11在NSCLC中過表達[8]，且MMP-10已被證明是NSCLC發生、發展所必需的[9]。本研究旨在探討apo M對NSCLC A549細胞株增殖、遷移、侵襲能力的影響及其與MMP-10的關系。

1 材料和方法

1.1 細胞系和主要試劑

NSCLC A549細胞系購自中國科學院細胞庫。Dulbecco改良Eagle培養基（Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM）購自美國康寧公司。胎牛血清購自美國賽默飛世爾公司 。慢病毒包裝及相關轉染試劑購自上海吉凱基因公司。RNA提取試劑盒（RNAiso Plus Reagent）購自上海申能博彩試劑公司。總蛋白提取試劑盒、二喹啉甲酸（bicinchonininc acid，BCA）蛋白定量試劑盒購自上海貝博生物公司。apo M、MMP-10抗體購自英國abcam公司。CCK-8試劑盒購自日本DojinDo公司。CX43型電子顯微鏡購自日本OLYMPUS公司。DM2500型共聚焦熒光顯微鏡購自德國Leica 公司。

1.2 細胞培養及慢病毒轉染

將A549細胞置于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養基中，放入37 ℃、5%CO2培養箱中培養。顯微鏡下估計細胞密度，當細胞密度為70%時，胰酶消化后重懸細胞，原細胞皿數∶傳代后細胞皿數按1∶5傳代繼續培養。根據試劑說明書要求進行apo M過表達和空載慢病毒感染。將A549細胞接種于6孔板中（2×105個細胞/mL），細胞達到50%融合度后，更換含有慢病毒的細胞培養基，并加入慢病毒感染增強液[ENI.S和polybrene，即Polybrene（E）]4 μL，以促進慢病毒轉染。成功感染的細胞為綠色熒光蛋白陽性，72 h后在熒光顯微鏡下觀察并使用實時熒光定量聚合酶鏈反應（realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）評估apo M過表達的效率。以轉染空慢病毒的細胞作為陰性對照。

1.3 qRT-PCR檢測

采用Trizol試劑提取總RNA，然后采用MMLV逆轉錄酶逆轉錄合成互補DNA（complementary DNA，cDNA）。 使用SYBR Premix Ex Taq試劑（日本TAKARA公司）進行qRT-PCR。循環參數：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。檢測儀器為QuantStudio 6實時熒光定量PCR儀（美國ThermoFisher Scientific公司）。采用2-△△Ct計算mRNA相對表達量。apo M、MMP-10基因及內參基因的引物及探針序列見表1。

表1 apo M基因、MMP-10基因及內參基因的引物及探針序列

1.4 采用CCK-8法檢測細胞增殖倍數

轉染成功24 h后收集細胞，將細胞分為陰性對照組（轉染空慢病毒）及apo M-OE組（轉染apo M慢病毒）。根據細胞計數結果，用完全培養基將2個組的細胞制成4×104個/mL的細胞懸液。取4塊96孔板，每孔加入100 μL制備好的細胞懸液，分別于0、24、48、72 h使用CCK-8法檢測apo M-OE組和陰性對照組的細胞增殖倍數。用含10%胎牛血清的DMEM培養基將CCK-8溶液按1∶9比例稀釋，以此稀釋液代替待測孔中的培養基，于37 ℃、5%CO2恒溫培養箱中培養1～4 h，檢測450 nm處的吸光度（A）值，計算細胞增殖倍數。

1.5 劃痕實驗

轉染24 h后，在6孔板中接種（2×105個細胞/mL）并孵育48 h，細胞密度達到70%后，用10 μL加樣槍槍頭在孔板中心軸處劃痕過底板，使用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）快速清洗2遍后，加入含1%血清的培養液，于0、24、48、72和96 h取樣攝片，記錄劃痕間距并計算閉合速率。

1.6 Transwell細胞侵襲實驗

轉染成功24 h后收集細胞，將細胞分為陰性對照組（轉染空慢病毒）及apo M-OE組（轉染apo M慢病毒）。將所有細胞在無血清培養基中培養12 h后消化，PBS清洗2遍，重懸于含10 g/L牛血清白蛋白的無血清培養基中。Transwell細胞侵襲實驗在24孔8 mm Transwell板中進行，上室加入1×105個細胞，無血清培養，下室加入10%血清培養基，在37 ℃、5%CO2條件下培養48 h。甲醇固定，結晶紫染色，PBS清洗，在DM2500型共聚焦熒光顯微鏡下觀察并計數。

1.7 免疫印跡法檢測細胞apo M和MMP-10相對表達量

收集陰性對照組和apo M-OE組細胞，PBS清洗3次后，使用含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液提取總蛋白，采用BCA法進行定量檢測。100 ℃變性5 min后采用10%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）分離30 mg蛋白質樣本。將蛋白質轉至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，采用5%BSA 4 ℃封閉過夜后，依次孵育相應的一抗和二抗。最后進行顯色并統計灰度值，計算相對表達量。

1.8 統計學方法

采用GraphPad 5.0軟件進行統計分析。所有實驗均獨立重復3次。組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 apo M-OE組與陰性對照組apo M表達的比較

apo M-OE組和陰性對照組細胞轉染情況見圖1（a）。與陰性對照組相比，apo M-OE組apo MmRNA相對表達量明顯上調（P＜0.01），約為陰性對照組的28倍，見圖1（b）。

圖1 A549細胞的轉染情況及apo M mRNA的表達水平

2.2 過表達apo M對A549細胞增殖的影響

轉染24及48 h后，apo M-OE組細胞增殖倍數明顯高于陰性對照組（P＜0.001）；轉染72 h時，apo M-OE組增殖速率與陰性對照組一致，推測為細胞增殖過多堆疊所致。見圖2。

圖2 過表達apo M對A549細胞增殖的影響

2.3 過表達apo M對A549細胞遷移、侵襲的影響

劃痕實驗結果顯示，與陰性對照組比較，從48 h開始，apo M-OE組A549細胞空白視野顯著減少，閉合速率顯著加快，即細胞遷移率更大（P＜0.001）。見圖3。

Transwell細胞侵襲實驗結果顯示，培養48 h后，apo M-OE組A549細胞侵襲率顯著高于陰性對照組（P＜0.001）。見圖3。

圖3 過表達apo M對A549細胞遷移、侵襲能力的影響

2.4 apo M-OE組和陰性對照組細胞中MMP-10的表達

采用qRT-PCR及免疫印跡法檢測apo MOE組和陰性對照組細胞MMP-10 mRNA及蛋白的表達。結果顯示，apo M-OE組MMP-10 mRNA及apo M、MMP-10蛋白表達量顯著高于陰性對照組（P＜0.05）。見圖4、圖5。

圖4 apo M-OE組和陰性對照組apo M的表達

圖5 apo M-OE組和陰性對照組MMP-10的表達

3 討論

截止到2015年，在我國成年男性中，肺癌的年發病率及年死亡率均居第1位，每年新發病例為73.3萬，其中男性為48.9萬例；每年約有59.1萬例患者死于肺癌，其中男性為40.2萬例[10]。由此可見，深入研究肺癌的發生、發展，探尋新的獨立標志物刻不容緩。

有研究結果顯示，apo M可能參與了腫瘤的發生、發展[11-12]。JIANG等[11]的研究結果顯示，肝癌患者血漿apo M水平高于正常對照組（P＜0.01）。有研究結果顯示，腸癌組織中apo MmRNA及蛋白水平明顯低于正常組織及良性病變組織（P＜0.05），結直腸癌組織中apo MmRNA表達水平與淋巴結轉移有關[12]。由此可見，apo M與腫瘤的發展有關，且在不同腫瘤中表現出促進或抑制作用。本研究結果顯示，apo M過表達對A549細胞的增殖、遷移、侵襲能力均表現出促進作用，這提示apo M可能通過某些復雜機制促進NSCLC的發展。

MMP與腫瘤的發展和轉移有關。有研究結果顯示，MMP-10在NSCLC和經Kras轉化的BASC肺癌起始細胞中過表達[13]。體外實驗結果顯示，MMP-10是NSCLC轉化生長及侵襲所必需的[8]。MMP-10在體內實驗中也表現出同樣重要的作用[13]。

ZHANG等[14]的研究結果顯示，與正常組織比較，肺癌組織MMP-10 mRNA水平顯著降低（P＜0.05），MMP-10蛋白水平顯著升高（P＜0.01）。ZHU等[15]的研究結果顯示，肺癌組織中apo MmRNA及蛋白水平均顯著高于正常組織，apo M可促進A549細胞的增殖和侵襲，其機制為apo M通過上調鞘氨醇-1-磷酸受體-1（sphingosine-1-phosphate receptor-1，S1P1）并激活細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK1/2）和磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositide-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱Akt）通路來參與NSCLC的生長調節。PI3K/Akt通路可調節多種轉錄因子，并參與腫瘤的發生、發展[16]。另外，apo M還可通過與1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate，S1P）結合等作用參與動脈粥樣硬化和炎癥刺激等[17]，且MMP-10也與此相關[18]。提示apo M與MMP-10可能存在某種聯系。本研究結果顯示，過表達apo M的A549細胞中MMP-10 mRNA和蛋白表達明顯上調。這提示在A549細胞中，apo M與MMP-10存在聯系，并有可能存在復雜的調節機制。

ZHANG等[19]的研究結果顯示，IL-6可通過人肺腺癌細胞系中兩面神激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/信號傳導及轉錄激活因子-3（signal transducer and activator of transcription，STAT3）信號通路調節MMP-10的表達。還有研究結果顯示，apo M的表達受激素水平、炎性因子及生長因子等諸多因素的調節[20-21]，其與IL-6呈負性調節關系。本研究分別對轉染apo M慢病毒的A549細胞和轉染空慢病毒的A549細胞進行了細胞增殖實驗、細胞劃痕實驗和Transwell細胞侵襲實驗。結果顯示，過表達apo M可促進A549細胞增殖、遷移及侵襲，還可上調MMP-10的表達。但apo M在NSCLC中的作用機制及通路尚待進一步研究。除了本研究進行的apo M過表達研究外，干擾A549細胞中的apo M表達是否會產生影響，apo M對除A549外的其他肺癌細胞系是否具有相似作用，均是下一步研究的目標。另外，后續將對apo M與MMP-10相互作用的信號通路進行研究，包括在過表達apo M的A549細胞中使用MMP-10阻滯劑，觀察其細胞功能學改變以及擴大實驗對象，采用多種處理因素觀察結果等。

綜上所述，apo M過表達可促進A549細胞的增殖、遷移和侵襲，并上調A549細胞中MMP-10的表達。