黃龍病菌在溫州蜜柑植株體內繁衍與自然擴散模型

孟幼青，汪恩國，余繼華，鐘列權，李艷敏，殷琛

(1.浙江省植保檢疫與農藥管理總站，浙江 杭州 310020； 2.臨海市農技推廣中心，浙江 臨海 317000；3.臺州市黃巖區植物檢疫站，浙江 黃巖 318000； 4.臺州市植物保護檢疫站，浙江 椒江 318000)

柑橘黃龍病(Citrus Huanglongbing，HLB)作為一種寄生于柑橘韌皮部篩管細胞的革蘭氏陰性細菌，可干擾線粒體和葉綠體正常功能，致樹冠梢葉失綠黃化、果實著色異常和組織器官營養輸送受阻，最終導致柑橘全株枯死[1]。浙江是我國柑橘重要產區之一，主栽溫州蜜柑品種，為了研究黃龍病在溫州蜜柑果園自然入侵擴散規律，提高監測預警和應急防控水平，經濟有效控制擴散危害，謝鐘琛等[2]和陳慈相等[3]先后對福建和江西贛南柑橘黃龍病的空間發生動態進行了全面研究，許長藩等[4]研究了黃龍病介體柑橘木虱傳播規律，但對黃龍病菌在溫州蜜柑植株體內繁衍、果園自然感染時序發生規律及其擴散模型等缺乏系統研究[5-7]。對此，筆者運用病穗嫁接接種法，對感染黃龍病的溫州蜜柑植株進行逐月抽樣和黃龍病PCR檢測，探索溫州蜜柑植株體內黃龍病菌繁衍擴散規律。2002—2016年在自然隔離屏障良好的溫州蜜柑果園采取定株長期跟蹤調查，探明黃龍病自然入侵擴散規律，以期為柑橘種苗檢疫、風險預警和防控決策提供依據。

1 材料與方法

1.1 黃龍病菌在植株體內繁衍與擴散測定

1.1.1 葉片黃龍病菌PCR檢測

選擇浙江柑橘黃龍病發生流行區，確定3年生溫州蜜柑發病植株5株，當年12月集中移植在40目防蟲網罩內，次年1—12月每月25日對植株進行采樣，并進行黃龍病PCR檢測，同時觀察記錄采樣葉片癥狀。于每株植株的東南西北中方位采同齡葉片各1張，每株5葉為1個樣品，每次采5個樣，采樣1次檢測1次，全年共采樣檢測60個樣300張葉片。

1.1.2 植株潛伏期嫁接法測定

供試種苗為1年生無病早熟溫州蜜柑、晚熟溫州蜜柑和椪柑苗木。每個品種種植7株，栽后及時搭建鋼管結構棚，外用80目尼龍網罩住，防止柑橘木虱進入，期間正常施肥用藥管理。于當年的3月14日、3月24日分別取典型斑駁黃化癥狀的、可確診已感染黃龍病的溫州蜜柑枝條作為帶菌接穗，于離地10 cm處對供試種苗采用切腹法嫁接，每接穗具3芽保證足夠病菌，嫁接口用塑料藥膜包扎保濕，保留原植株干枝葉。接穗成活后解去塑料藥膜，及時抹除接穗上抽生的梢芽，同時保持土壤濕潤，清除雜草，肥培管理，維持接穗成活。嫁接后每隔5～7 d觀察記載各品種植株葉片黃化情況，按斑駁型、均勻黃化型和缺素黃化型做好觀察記錄，并于第2年進行黃龍病菌PCR檢測。

1.2 植株感病與自然擴散跟蹤

1.2.1 果園概況

選擇四面環山環水、隔離屏障良好的自然感染果園，樹齡18 a，2002年首次查見黃龍病紅鼻果。該果園為砂性紅黃壤土，土層深厚，土壤偏酸性，pH 5.5～6.5，肥力中等。

1.2.2 試驗品種

供試品種為早熟溫州蜜柑宮川品系，種植密度900株·hm-2，單株樹冠綠葉面積一般5～6 m2，常年春梢期3—4月，夏梢期5—7月，秋梢期8—10月，掛果期5—11月。

1.2.3 處理設計

于2002—2016年確定3塊上述自然感染果園樣地，2002年供試樣地Ⅰ首次查見2株病株，樣地Ⅱ和樣地Ⅲ未查見病株，對樣地不作挖除病樹、防治柑橘木虱和補植枯死株空間苗木處理，任其病情自然擴散流行。每樣地劃定500 m2方形塊，塊內選定橘樹45株，于每年的11月上旬果實轉色成熟期，依據顯癥紅鼻果進行調查，逐年跟蹤調查黃龍病自然發病擴散情況。

1.3 調查統計

調查以株為單位記載病情級別，按年度統計當年新發病率、當年新增病指、積年發病率和積年病指等。9級病樹次年以自然死亡按減株論處，不再列入調查基數和發病樹統計范疇。病情分級標準為:0級，全樹無病；1級，樹冠有1～2個果枝顯癥；3級，顯癥病果枝占全樹的1/3以下；5級，顯癥病果枝占全樹的1/3以上至2/3以下；7級，顯癥病果枝占全樹2/3以上；9級，全樹死亡。

當年新發病率(%)=當年新增發病株數/調查樹株數×100；

當年新增病指=∑當年新增病樹病級之和/(調查總樹數×病級最高級)×100；

積年發病率(%)=當年發病樹株數/調查樹株數×100；

積年病指=∑(當年感染病樹病級總和)/(調查總樹數×病級最高級)×100。

2 結果與分析

2.1 黃龍病菌在植株體內繁衍擴散模型

表1顯示，當年12月集中移植于網罩內的溫州蜜柑，次年逐月進行植株葉片黃龍病菌PCR檢測，其1—12月植株葉片黃龍病菌平均檢出率分別為48%、52%、44%、40%、88%、84%、80%、84%、96%、88%、92%和96%。表明溫州蜜柑植株體內黃龍病菌繁衍擴散呈Logistic模型發展軌跡，擬合后得出發病率的擴散模型為L=101.452 2/(1+EXP(0.739 5-0.305 8 M))(df=12，P=0.001 4，r=0.875 4**)。根據模型模擬計算得出，從5%以下植株葉片檢出黃龍病菌的初次感染期，到95%以上的植株葉片感染黃龍病菌的擴散時間為20～22個月(圖1)。

表1 柑橘黃龍病嫁接傳染與顯癥規律試驗觀察

圖1 溫州蜜柑植株體內黃龍病菌繁衍動態與模擬軌跡

溫州蜜柑植株體內黃龍病菌繁衍發展速度總體較常規細菌緩慢，一般從初次感染到植株顯癥潛伏期較長。50%左右的植株葉片感染黃龍病菌時就會表現葉片黃化或黃梢等癥狀。由表1可知，幼齡植株感染顯癥潛伏期短的為6個月，長的可達21個月，從感染到顯癥平均為10.5個月，與上述植株葉片黃龍病菌繁衍速度基本相似。

2.2 植株自然感病與擴散動態模型

2.2.1 年序新發病率變化動態

由表2可知，2002—2016年溫州蜜柑黃龍病年序間新發病率呈波浪形曲線，3個樣地變化趨勢基本一致，1—12月當年新發病率均值分別為1.48%、2.96%、2.96%、9.63%、10.37%、14.50%、7.75%、10.94%、8.59%、8.93%、11.65%、3.06%、2.27%、6.02%、8.22%，經歷4個高峰后則全園發病。從首次發現病株后，年序新發病率漸趨上升，至第4～6年形成第1波新發病高峰，峰期2～3年，2005—2007年樣地Ⅰ新發病率分別為15.56%、11.11%和13.64%，較初始發病率增加1.5～2.5倍；2007年樣地Ⅱ新發病率16.28%，較初始發病率增2.7倍；2006—2007年樣地Ⅲ新發病率分別為13.33%和13.64%，較初始發病率增5.0～5.1倍，積年發病率均值為39.69%。第8年(2009年)形成第2波高峰，峰期為1年，即樣地Ⅰ、樣地Ⅱ和樣地Ⅲ的當年新發病率分別為11.90%、11.90%和9.09%，較初始發病率增1.7倍、1.7倍和3.1倍，積年發病率均值為57.03%。第10～11年(2011—2012年)形成第3波高峰，峰期為1～2年，2012年樣地Ⅱ新發病率19.44%，2011—2012年樣地Ⅲ新發病率分別為14.63%、10.00%，樣地Ⅰ則不明顯，積年發病率均值達78.64%。第14～15年(2015—2016年)顯現翹尾峰，2016年樣地Ⅰ、樣地Ⅱ新發病率分別為11.11%、7.41%，2015—2016年樣地Ⅲ新發病率分別為9.68%、7.14%，其積年發病率均值分別為85.54%和91.78%。由于樣地Ⅰ初顯病株較樣地Ⅱ、樣地Ⅲ早1年，按初始發病顯癥年序均值統計，入侵第1年初始發病率為3.70%，至第4～5年上升為第1高峰，新發病率分別為11.85%和13.68%，較初始發病率增2.2～3.7倍；第7～8年為第2高峰，新發病率分別為10.10%和10.21%，較初始發病率增1.7～1.8倍；第10年新發病率為10.82%，形成第3高峰；第14～15年新發病率分別為6.44%和11.11%，出現尾峰后則趨向全園發病。

表2 2002—2016年溫州蜜柑果園自然感染黃龍病植株演變情況

2.2.2 年序新增病指變化動態

由圖2可知，3個樣地溫州蜜柑黃龍病年序新增病情指數變動趨勢表現一致，自入侵后5～6 a形成初次高峰后，呈現年升年降規律波動，較年序新發病率曲線波動頻率高且細致潤滑。2002年樣地Ⅰ新增病指0.99，樣地Ⅱ和樣地Ⅲ病指為0；2003年樣地Ⅰ、樣地Ⅱ和樣地Ⅲ新增病指分別是1.23、0.49和0.25；2004—2005年樣地Ⅰ新增病指分別為2.22和6.67，樣地Ⅱ為0.74和3.21，樣地Ⅲ為0和2.72；至2006—2007年快速上升形成第1高峰，樣地Ⅰ新增病指分別為10.12和10.67，樣地Ⅱ為4.94和9.30，樣地Ⅲ為4.94和5.56，調查樣地新增病指均值分別是6.67和8.49，積年病指均值為12.84和8.66。隨后各樣地年序新增病指均呈1降1升規律變化，2008—2016年新增病指均值分別為1.72、10.76、4.98、11.85、7.83、11.90、6.96、12.90和2.03，說明溫州蜜柑黃龍病從初次入侵至全園擴散流行的最大周期為14～15 a，到2015年后樣地積年病指均值達50以上，果園嚴重感病。

圖2 溫州蜜柑黃龍病年序新增病指變化動態

2.2.3 積年性發病擴散動態模型

溫州蜜柑黃龍病積年性發病擴散主要包括病情擴散面(當年發病率)和嚴重度(當年病情指數)2方面，當年積年發病率是黃龍病擴散能力或擴散速率指標。圖3顯示，溫州蜜柑黃龍病積年發病率呈Logistic曲線上行走勢，其擴散危害隨時序推進漸趨上升，溫州蜜柑黃龍病積年發病率(Y:%)與入侵年序(N)數值化(設2002年為初始入侵年，且N=1，2，3，…，n)數學模型為:Y=87.458 5/[1+EXP(3.426 3-0.506 543N)](df=15，F=766.482 3，P=0.000 1，r=0.996 1**)。表明溫州蜜柑黃龍病年度間發病率隨初次感染顯癥年序遞增而擴散，其入侵擴散呈周期性變化規律，即無病果園一旦感病顯癥3 a后快速擴散，至第14～15年趨向峰值，積年發病率達90%以上，此后徘徊在漸近線邊緣緩慢上升。

圖3 溫州蜜柑黃龍病積年性擴散軌跡

溫州蜜柑黃龍病積年病指趨勢也呈Logistic曲線上行走勢，病情隨時序推進而漸趨加重，其積年病情指數(I)與入侵年序數值化(N)數學模型為:I=59.344 1/[1+EXP(3.521 7-0.410 348N)](df=15，F=304.300 1，P=0.000 1，r=0.990 3**)，表明病情呈周期性變化規律，即當無病果園一旦感病顯癥后，自第2年開始病指漸趨上升，至第14～15年病情趨向峰值，病指55以上，積年發病率90%以上，此后病情增速趨緩，在漸近線邊緣緩慢徘徊上升，發病顯癥持續14～15 a后可擴散至整個果園。

3 小結與討論

3.1 潛伏期與體內病菌繁衍速率相關

植株潛伏期嫁接法和黃龍病PCR測定表明，溫州蜜柑黃龍病一般在50%的植株葉片帶菌時顯癥，其體內繁衍擴散模型L=101.452 2/(1+EXP(0.739 5-0.305 8M)) (r=0.875 4**)，即從植株5%的葉片到95%葉片帶菌，過程所需20～22個月。與溫州蜜柑幼齡植株嫁接感染顯癥潛伏期一般短的6個月，長的21個月，平均10.5個月基本相似。

3.2 自然感病擴散大周期14～15 a

黃龍病積年性發病流行主要受寄主、病源量、介體種群數、果園發病史和環境條件等諸多因素影響，發病至高位的時序范圍較大，有報道為3～13 a[7-8]。本研究通過長期跟蹤調查，溫州蜜柑果園初次遭受黃龍病入侵，若不加以控制自然擴散流行，則第4～5年形成第1個高峰，其新發病率25%左右；第7～8年形成第2個高峰，新發病率20%左右；第10年形成第3個高峰，新發病率11%左右；第14～15年形成尾峰，新發病率9%左右。綜合溫州蜜柑黃龍病長期自然擴散特征分析，14～15 a會趨向全園發病流行。

3.3 積年性擴散呈Logistic上行曲線

溫州蜜柑黃龍病積年性發病率(Y:%)與入侵年序(N)數值化擴散模型為Y=87.458 5/[1+EXP(3.426 3-0.506 543N)](r=0.996 1**)；積年病情指數(I)與入侵年序數值化(N)擴散模型為I=59.344 1/[1+EXP(3.521 7-0.410 348 N)](r=0.990 3**)。由此可知，其自然入侵擴散呈Logistic曲線上行走勢，病情指數隨時序推進漸趨加重，表現周期性變化規律，即果園首次查見顯癥病株后持續14～15 a，處于徹底毀園狀態。這些規律和擴散模型對開展柑橘類種苗檢疫和黃龍病風險預警，以及疫情防控決策等具有重要指導意義。