美拉德反應(yīng)對(duì)玉米蛋白水解物功能特性的影響

（商丘學(xué)院風(fēng)景園林學(xué)院，河南商丘476000）

玉米蛋白含有必需氨基酸，尤其是賴氨酸、蛋氨酸和蘇氨酸，具有良好的乳化性、發(fā)泡能力、保水性和溶解性等性能，另外還具有抗菌，抗高血壓等生理活性。然而，玉米蛋白含有高含量的疏水性氨基酸，并且在應(yīng)用方面具有一定的限制。為了改善玉米蛋白的功能性和應(yīng)用，可以通過(guò)物理、化學(xué)和酶促等方法進(jìn)行改性。程宇等[1]探討了馬鈴薯蛋白肽與Tween 20作為共乳化劑制備的乳狀液的影響機(jī)制。最終顯示出，馬鈴薯蛋白肽能夠有效的降低乳狀液的脂肪氧化率。雖然，玉米蛋白肽表現(xiàn)出很好的功能特性，但有研究表明，酶解反應(yīng)會(huì)使玉米蛋白肽喪失部分功能特性，嚴(yán)重阻礙了玉米蛋白肽的應(yīng)用[2]。為了增加玉米蛋白肽在食品體系中的應(yīng)用范圍，針對(duì)玉米蛋白肽進(jìn)行適當(dāng)?shù)母男砸蕴嵘涔δ芴匦燥@得尤為重要。

美拉德反應(yīng)是指氨基酸（通常是氨基酸或蛋白質(zhì)）與還原化合物（如還原糖類）之間的非酶褐變反應(yīng)。美拉德反應(yīng)具有蛋白質(zhì)改性的作用，可以很好的提高物質(zhì)的生物活性。相比化學(xué)改性而言，安全問(wèn)題可以得到保障，是一種安全、可靠的改性方法。美拉德反應(yīng)擁有一個(gè)龐大的反應(yīng)過(guò)程，能夠生成還原酮、類黑精、噻吩、吡嗪等物質(zhì)[3]。美拉德反應(yīng)除了能提高原料的抗氧化活性外，還能夠提高反應(yīng)原料的熱穩(wěn)定性，生成具有一定的抑菌活性的物質(zhì)[4-5]。此外，還能進(jìn)一步改善物質(zhì)的乳化性質(zhì)和起泡性質(zhì)，在提高蛋白質(zhì)的溶解性、發(fā)泡性、熱穩(wěn)定性、乳化性以及抗氧化性能等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。因此，本試驗(yàn)采用美拉德反應(yīng)對(duì)玉米蛋白水解物（zein protein hydrolysate，ZPH）進(jìn)行改性，利用玉米蛋白水解物與半乳糖（galactose，Gal）制備美拉德反應(yīng)產(chǎn)物（Maillard reaction products，MRPs），探討不同pH值對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物起泡性質(zhì)、表面疏水性、溶解性、抗氧化能力以及乳化性質(zhì)的影響，為提高蛋白質(zhì)的功能特性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米蛋白（蛋白含量≥75%）：廣州千勝精細(xì)化工有限公司；半乳糖、堿性蛋白酶（酶活為2.4 AU/g）、ABTS：美國(guó)Sigma公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（分析純）：上海穎心實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JD500-2電子天平：沈陽(yáng)龍騰電子稱量?jī)x器有限公司；GL-21M冷凍離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；UT-1800紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；DK-8B電熱恒溫水浴鍋：上海驚宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PHS-25型pH計(jì)：上海精科雷磁儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 玉米蛋白水解物的制備

稱量一定質(zhì)量的玉米蛋白，配制成60 mg/mL的溶液，磁力攪拌4 h，加入堿性蛋白酶（酶與底物濃度質(zhì)量比為1∶50），55℃水解2 h，加入1 mol/L的NaOH溶液保持pH值約為8.0將溶液置于95℃沸水中加熱10 min，冰浴冷卻使其達(dá)到25℃，最后用1 mol/L的HCl將溶液的pH值調(diào)至7.0。將得到的水解物進(jìn)行冷凍干燥，使用雙縮脲方法測(cè)定蛋白水解物的含量，以便后期試驗(yàn)使用。

1.3.2 玉米蛋白水解物的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物

將ZPH的濃度配制為20 mg/mL，與半乳糖按照1：2質(zhì)量比進(jìn)行配制。取10 mL加入到帶塞玻璃管中，塞緊后水浴加熱（90℃）3 h和6 h后立即冷卻，4℃下保存獲得的MRPs。

1.3.3 溶解性的測(cè)定

將不同處理組的樣品用pH3.0～8.0的緩沖液進(jìn)行溶解。在25℃條件下攪拌30min使其充分溶解，4000r/min條件下離心20 min，上部清液中的蛋白質(zhì)含量表示為M1；樣品中總蛋白含量為表示為M2。計(jì)算公式如下：

溶解性/%=（M1/M2）×100

1.3.4 表面疏水性的測(cè)定

根據(jù)Akita等[6]的方法。用pH 3.0～8.0的緩沖溶液分別將不同處理組的樣品配置成濃度為1、5、8、10、20 mg蛋白/100 mL的溶液。將5 μL的8-苯胺萘磺-1-酸鹽溶液（8 mmol/L）加入到3 mL的蛋白溶液。設(shè)置的狹縫寬為10 nm，并在485 nm處進(jìn)行發(fā)射，374 nm處進(jìn)行激發(fā)。用相對(duì)的熒光數(shù)值H0除以蛋白的濃度（g/L）即為樣品的疏水性（R）。

1.3.5 起泡性以及起泡穩(wěn)定性的測(cè)定

根據(jù)Klompong等[7]的方法。稱取100 mg水解樣品分別溶于20 mL的pH 3.0～8.0的緩沖液中。在25℃下磁力攪動(dòng)30 min，測(cè)得體積為V1，再在20 000 r/min下均質(zhì)2 min后立即測(cè)定體積為V2。計(jì)算公式如下：

起泡性/%=（V2/V1）× 100

均質(zhì)后靜止放置1 h測(cè)定的體積為V3，計(jì)算公式如下：

起泡穩(wěn)定性/%=（V3/V2）× 100

1.3.6 乳化性以及乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

依據(jù)Pearce等[8]的方法稍做調(diào)整。將不同處理組的MRPs樣品，溶于緩沖溶液中（pH 3.0～8.0）。在25℃條件下磁力攪拌30 min后加入10 mL大豆油。在20 000 r/min條件下用勻漿機(jī)乳化1 min。乳化均質(zhì)0和10 min后取50 μL注入到5 mL 0.1%十二烷基磺酸鈉溶液的離心管中進(jìn)行混合，在500nm處進(jìn)行比色，乳化活力（EAI）及乳化穩(wěn)定性（ESI）用如下公式計(jì)算：

EAI/（m2/g）=（2×2.303×A0）/[0.25×蛋白質(zhì)量（g）]

ESI/%=A0×t10/（A0-A10）

式中：A0、A10為乳狀液在 0、10 min 的吸光度值；t10為10 min。

1.3.7 抗氧化能力的測(cè)定

根據(jù)Re等的方法[9]，并適當(dāng)修改。將配制好的7 mmol/L ABTS準(zhǔn)備溶液與過(guò)二硫酸鉀（2.45 mmol/L）混合，混合物在25℃下避光放置12 h～16 h。使用前用醋酸鈉緩沖溶液（pH 4.5，20 mmol/L）稀釋吸光度為0.7±0.02（734 nm處）。將稀釋10倍的MRPs樣品取100μL與3mL上述溶液混勻，避光放置6min，在734nm處進(jìn)行比色。計(jì)算公式如下：

式中：AC為反應(yīng)前ABTS工作液的吸光度值；AS為反應(yīng)后樣品溶液的吸光度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Statistix 8.1（分析軟件，St Paul，MN）軟件包中 Linear Models程序進(jìn)行，差異顯著性（P＜0.05）分析使用Tukey HSD程序，采用Sigmaplot 12.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 MRPs的溶解性

將ZPH和半乳糖以質(zhì)量比1：2進(jìn)行配比，并分別加熱3 h和6 h得到MRPs，與單獨(dú)的ZPH一起比較功能特性。圖1為不同pH值條件下ZPH和經(jīng)不同處理?xiàng)l件的ZPH-半乳糖體系生成的MRPs溶解性的變化趨勢(shì)。

圖1 不同pH值條件下美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的溶解性Fig.1 Solubility of Maillard reaction products under different pH conditions

未進(jìn)行修飾的ZPH在pH 3～8范圍內(nèi)的溶解度依次為 79.9%、78.8%、78.31%、80.4%、81.4%、81.3%；加熱6h后溶解性分別為81.3%、81.7%、81.2%、82.7%、83.3%、83.2%，與其他兩個(gè)處理組相比，ZPH-半乳糖美拉德反應(yīng)體系在加熱6 h后得到的MRPs的溶解度得到大幅度的改善。3組試驗(yàn)中在pH 5.0時(shí)的溶解性最差。這可以解釋為當(dāng)?shù)竭_(dá)蛋白的等電點(diǎn)時(shí)，正負(fù)電荷為零，蛋白間靜電排斥作用減弱，容易出現(xiàn)聚沉現(xiàn)象，使溶解性降低[10]。而當(dāng)pH值高于或低于5.0時(shí)，所帶電荷會(huì)極大的增加蛋白間的靜電排斥作用，聚集的現(xiàn)象得到改善，進(jìn)一步促進(jìn)了蛋白的溶解。

2.2 MRPs的表面疏水性

圖2為不同pH值條件下，ZPH與半乳糖的質(zhì)量比為1：2制得的MRPs的表面疏水性的趨勢(shì)變化情況。

圖2 不同pH值條件下美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的表面疏水性Fig.2 Surface hydrophobicity of Maillard reaction products under different pH conditions

與其他兩個(gè)處理組相比，加熱6 h制備的MRPs的表面疏水性要更低。不同的pH值對(duì)表面疏水性的影響較大，3個(gè)處理組的表面疏水性隨著pH值的增加都呈現(xiàn)顯著降低的趨勢(shì)（P＜0.05）。加熱6 h制備的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物表面疏水性在pH值為3.0時(shí)為17.3，而在pH值為8.0時(shí)僅為9.0。蛋白質(zhì)的疏水作用與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和功能性密切相連，能夠反映出疏水性氨基的含量[11]。此外，表面疏水性與pH值的大小有較為緊密的聯(lián)系。pH值的增大能夠明顯的降低疏水性，這可以解釋為發(fā)生美拉德反應(yīng)的玉米蛋白肽能夠?qū)⑹杷鶊F(tuán)集中在一起，而分子外部布滿大量的親水基團(tuán)導(dǎo)致疏水性逐漸降低[12]。與此研究結(jié)果相似，曹麗霞等[13]研究表明蕎麥分離蛋白與葡聚糖進(jìn)行美拉德反應(yīng)，蕎麥分離蛋白的表面疏水性能顯著提高。

2.3 MRPs的起泡性以及起泡穩(wěn)定性

不同pH值條件下美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的起泡性和起泡穩(wěn)定性見(jiàn)圖3。

ZPH和MRPs的起泡性質(zhì)是通過(guò)起泡性和起泡穩(wěn)定性來(lái)測(cè)定的。從圖3中能夠觀察到，ZPH在與半乳糖生成MRPs時(shí)，起泡性質(zhì)都有所提高，尤其是加熱6 h后得到的MRPs。3個(gè)處理組的起泡性質(zhì)都呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(shì)，在pH值為5.0時(shí)到達(dá)最低值，而當(dāng)pH值高于5.0時(shí)，又變?yōu)橹饾u上升的變化形勢(shì)，在pH值為8.0時(shí)達(dá)到最大值。不同的pH值3個(gè)處理組的起泡性質(zhì)的變化情況和溶解度的相一致，可見(jiàn)各處理組的起泡性質(zhì)與溶解度有著密切的聯(lián)系。分散介質(zhì)的pH值對(duì)起泡性能會(huì)起到一定的作用，在pH值為5.0時(shí)達(dá)到最低值，這是被理解為起泡性能受到蛋白可溶部分的影響，即溶解性的影響[14]。然而，蛋白質(zhì)的不溶部分能夠提高泡沫的表面黏度，從而對(duì)起泡性和起泡穩(wěn)定性起到促進(jìn)作用[15]。另外，加熱6 h獲得的MRPs起泡性和起泡穩(wěn)定性最好。

圖3 不同pH值條件下美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的起泡性和起泡穩(wěn)定性Fig.3 Foaming capacity and foam stability of Maillard reaction products under different pH conditions

2.4 MRPs的抗氧化性

不同pH值條件下美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化性見(jiàn)圖4。

圖4 不同pH值條件下美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化性Fig.4 Antioxidant activity of Maillard reaction products under different pH conditions

通過(guò)清除ABTS+·活性判斷不同pH值條件下ZPH與半乳糖形成MRPs的抗氧化性能。向不同pH值條件下玉米蛋白水解物與半乳糖制備的樣品中加入ABTS工作液，在734 nm處進(jìn)行比色，通過(guò)吸光值的減少來(lái)表示樣品的清除活性。由圖4可知，隨著pH值的增加，ZPH與半乳糖生成的MRPs的清除活性起初降低但隨后呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，在pH值為5.0時(shí)MRPs的自由基清除能力最差約為32.43%。說(shuō)明MRPs的抗氧化活性與pH值有關(guān)，且反應(yīng)的溫度越高，生成MRPs的抗氧化性越好。水浴加熱能夠增加多肽的氨基與半乳糖中羰基之間的分子運(yùn)動(dòng)，并且MRPs中含有揮發(fā)性的雜環(huán)物質(zhì)或焦糖類化合物，能夠增加MRPs的親電加成反應(yīng)，起到很好的清除自由基的作用。因此，ZPH與半乳糖進(jìn)行美拉德反應(yīng)時(shí)間為6 h時(shí)，所得到的MRPs的抗氧化能力最強(qiáng)。楊珮瑜等[16]研究了黃鯽蛋白肽分別與7種還原糖進(jìn)行美拉德反應(yīng)，顯示出美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有很強(qiáng)的抑菌效果和自由基清除活性。

2.5 MRPs的乳化性以及乳化穩(wěn)定性

不同pH值條件下美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的乳化性和乳化穩(wěn)定性見(jiàn)圖5。

圖5 不同pH值條件下美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的乳化性和乳化穩(wěn)定性Fig.5 Emulsifying activity index（EAI）and emulsion stability index（ESI）of Maillard reaction products under different pH conditions

如圖5所示，ZPH與半乳糖發(fā)生反應(yīng)后的產(chǎn)物的乳化性質(zhì)都有不同范圍的提高（P<0.05），尤其是加熱6 h后制備的產(chǎn)物。這可能是加熱使蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的結(jié)構(gòu)展開(kāi)，疏水基團(tuán)暴露出來(lái)，親油基團(tuán)增多，提高了加熱體系的乳化性質(zhì)[17]。并且伴隨pH值的增加，3個(gè)處理組的乳化性質(zhì)起初呈現(xiàn)降低但隨后有升高的趨勢(shì)，在pH值為5.0時(shí)到達(dá)最低。這一研究結(jié)果表明pH值對(duì)起泡性和溶解性的影響是相同的。與其他兩個(gè)處理組相比，ZPH-半乳糖美拉德反應(yīng)體系加熱6 h后，得到的MRPs乳化性和乳化穩(wěn)定性都得到了很好的改善。ZPH的乳化性和乳化穩(wěn)定性較差是因?yàn)榻?jīng)過(guò)重度水解得到的小分子肽的乳化能力較弱[18]。而MRPs的乳化性質(zhì)能夠得到提高，是因?yàn)榧訜岷笫沟鞍椎膬?nèi)部結(jié)構(gòu)展開(kāi)，大量的疏水基團(tuán)暴露出來(lái)同脂滴融合在一起，使乳化活性得到提高。張欣等[19]將豌豆蛋白水解物分別與葡萄糖、麥芽糊精和葡聚糖進(jìn)行溫和的美拉德反應(yīng)，顯著改善了豌豆蛋白水解物的乳化活性，并保留了抗氧化性。

3 結(jié)論

美拉德反應(yīng)可以改善玉米蛋白水解物的功能特性，且不同pH值和加熱時(shí)間對(duì)形成的MRPs的功能活性具有一定的影響。研究結(jié)果表明，pH值在等電點(diǎn)附近時(shí)MRPs的功能特性較差，且反應(yīng)體系加熱6 h可以顯著提高M(jìn)RPs的功能特性。加熱6 h后得到的MRPs溶解性得到大幅度的改善，并且受溶解度的影響，MRPs的起泡性能顯著提高。美拉德反應(yīng)使蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的結(jié)構(gòu)展開(kāi)，疏水基團(tuán)暴露出來(lái)，導(dǎo)致表面疏水性逐漸降低，乳化性能增加。此外，由于MRPs中含有揮發(fā)性雜環(huán)物質(zhì)或焦糖類化合物，能夠提升玉米蛋白肽的抗氧化活性。綜上，可以通過(guò)應(yīng)用美拉德修飾的方式來(lái)提高ZPH的功能特性。根據(jù)玉米蛋白水解物與半乳糖反應(yīng)產(chǎn)物的優(yōu)良性質(zhì)，為玉米蛋白肽在食品工業(yè)上的應(yīng)用提供理論支持，為蛋白質(zhì)的深入研究開(kāi)辟新的方向。