兩款果香型牡蠣肽飲料的研制

李婉，曹文紅，*，章超樺，秦小明，鄭惠娜，林海生

（1.廣東海洋大學深圳研究院，廣東深圳518108；2.廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江524088）

眾所周知，海洋食品是人類必需營養物質和生物活性化合物的來源，并且富含生物活性肽。小分子肽易被吸收，這些肽在人體中調節生物效應。從海洋生物中提取的生物活性肽具有藥理作用。與合成藥物相比，這些活性肽被認為更溫和、更安全，沒有副作用。近年來，各種蛋白肽受到廣泛關注，這些小肽具有一定的人體代謝和生理調節功能，可以在腸道內直接被吸收，吸收速度要比游離氨基酸和蛋白質快 2倍～3倍，有促進免疫、激素調節、抗菌、抗病毒、降血壓、降血脂等作用，是開發功能食品的新資源[1]。

牡蠣是世界第一大養殖貝類，也是我國養殖產量最大的經濟貝類，且產量居全球首位。牡蠣中含有豐富的蛋白質，素有海洋牛奶的美譽。據世界糧農組織評定，牡蠣肉中必需氨基酸完全程度和質量優于牛乳和人乳。牡蠣在《本草綱目》中早有記載：“化痰軟堅，清熱除濕，止心脾氣痛，痢下赤白濁，消廟癮積塊，瘦疾結核”等。牡蠣作為海洋豐富的天然活性肽資源庫，目前已發現牡蠣肽具有抗腫瘤、抗氧化、抗疲勞、改善記憶、血管緊張素轉換酶抑制劑、抑菌、解酒護肝、免疫調節[2-6]等生物活性。同時，牡蠣也是一種藥食同源的食品，利用其這一特點開發各種保健和功能性食品已成為牡蠣加工利用的主要方向。

國內外關于牡蠣的加工利用有很多，主要集中片劑、膠囊、口服液等營養功能性產品。關于牡蠣肽飲料方面的產品幾乎沒有，本研究在課題組前期對牡蠣肉營養成分[7]、酶解[8]、脫色[9]、脫腥[10]、風味成分[11-12]及生物活性[13-14]等研究基礎上，以牡蠣肽為原料，通過正交和響應面優化試驗研制兩款風味宜人的果味牡蠣肽營養保健飲料。

1 材料與儀器

1.1 試驗材料

香港牡蠣：湛江市東風市場；風味蛋白酶（18萬U/g）：廣西南寧龐博生物工程有限公司；羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose，CMC-Na）：上海申光食用化學品有限公司；粉末活性炭、顆粒活性炭：佛山市巴珊環?；び邢薰?；硅藻土：濟南鑫龍晟生物科技有限公司；果膠：廣東新如榮生物科技有限公司；蔗糖：湛江冬源食品有限公司；三氯蔗糖：鹽城捷康三氯蔗糖制造有限公司；甜菊糖苷：廣州市凱文食品發展有限公司；羅漢果粉：上海今良食品技術有限公司；姜粉：亳州寶豐生物科技有限公司；水蜜桃粉：西安福瑞德食品飲料有限公司；薄荷香精：嘉興大好家食品科技有限公司；椰漿粉：海南南派實業有限公司。

1.2 試驗儀器

UV757紫外可見分光光度計、PHS-2F pH計：上海精密科學儀器有限公司；電子分析天平：上海天平儀器廠；Sigma 3k15離心機：德國希格瑪離心機有限公司；GZX數顯不銹鋼鼓風干燥箱：上海啟威電子有限公司；SHZ-B型恒溫水浴振蕩器：江蘇金壇市佳美儀器有限公司；HHT4-LX-C50L型立式壓力蒸汽滅菌器：北京中西遠大科技有限公司；MultiskanFC型酶標儀：美國Thermo公司；JM-50膠體磨：上海貝工泵業制造有限公司；VAPODEST450全自動凱氏定氮儀：德國Gerhardt公司。

1.3 分析方法

蛋白質含量的檢測：按照GB 5009.5-2010《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》中凱氏定氮法測定；總糖含量測定：按照GB/T 9695.31-2008《肉制品總糖含量測定》中分光光度法測定；水解氨基酸的測定：GB/T 5009.124-2016《食品安全國家標準食品中氨基酸的測定》中茚三酮柱后衍生離子交換色譜儀測定；菌落總數測定：GB4789.2-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》；大腸菌群測定：GB4789.3-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數》；其他致病菌的測定：GB4789.4-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》、GB4789.10-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》。

1.4 試驗方法

1.4.1 工藝流程

清香型牡蠣肽飲料工藝流程：牡蠣肽粉→脫腥→過濾→調配→穩定劑→均質→灌裝→殺菌→冷卻→成品→感官、理化評定

椰香型牡蠣肽飲料工藝流程：牡蠣肽粉→脫色→離心→過濾→調配→穩定劑→調節pH值→均質→灌裝→殺菌→冷卻→成品→感官、理化評定

1.4.2 操作要點

牡蠣肽粉：牡蠣肉按參考文獻[15]進行酶解，酶解液經5 kDa超濾膜過濾后濃縮，最終噴霧干燥得到牡蠣肽粉。其酸溶蛋白含量55.91%，游離氨基酸含量7.30%，肽含量51.48%，水分含量為5.56%，分子量＜3 000 Da占99.7%。

調配：清香型牡蠣肽飲料將牡蠣肽、水蜜桃粉、蔗糖，甜菊糖苷，薄荷香精按正交試驗所得的最佳比例調配均勻；椰香型牡蠣肽飲料將牡蠣肽、椰漿粉、蔗糖、甜菊糖苷按響應面試驗所得最佳比例調配均勻。

脫腥：清香型牡蠣肽飲料使用姜粉和羅漢果粉進行單因素試驗，對牡蠣肽進行脫腥。

脫色：椰香型牡蠣肽飲料選擇顆粒活性炭、粉末活性炭和硅藻土進行單因素試驗，取100 mL上清液，加入脫色劑，40℃下磁力攪拌40 min，脫色完成后4℃下4 000 r/min離心20 min，得到上清液。上清液進行抽濾，得到脫色液。最后計算脫色率、氮損失率。

按下列公式計算脫色率：

式中：A1為脫色前的吸光度值；A2為脫色后的吸光度值。

采用二喹啉甲酸法蛋白濃度定量試劑盒分別測定脫色前后牡蠣多肽溶液中多肽含量，按下列公式計算：

式中：m1為脫色前多肽的含量，g；m2為脫色后多肽的含量，g。

穩定劑：選擇CMC-Na和果膠進行正交試驗，取10 mL飲料，經過3 000 r/min離心10 min，在660 nm處測定其離心前后的吸光度，計算其懸浮穩定性。懸浮穩定性計算公式如下：

式中：A1為離心后吸光度；A2為離心前吸光度。

1.4.3 感官評價

采用100分制，隨機請10位師生（5男5女）對兩款果香型牡蠣肽飲料進行感官評價，每項進行評定打分，指標體系和內容見表1。

表1 牡蠣肽飲料感官分析評定標準Table 1 Standard for sensory analysis and evaluation of oyster peptide beverage

1.4.4 最佳配方的確定

1.4.4.1 清香型牡蠣肽飲料

牡蠣肽飲料采用單因素試驗所確定的蔗糖添加量，甜菊糖苷添加量，水蜜桃添加量和薄荷香精添加量為4因素，以牡蠣肽飲料感官評分為指標，根據各因素的不同配比對牡蠣肽飲料的感官評定結果進行L9（34）正交試驗，確定清香型牡蠣肽飲料的最佳配方，因素水平表見表2。

表2 清香型牡蠣肽飲料配方L9（34）正交優化試驗的因素水平Table 2 Factors and levels of orthogonal optimum test L9（34）for refreshing fragrance oyster peptide beverage formula

1.4.4.2 椰香型牡蠣肽飲料

使用Design-expert 8.0軟件進行響應面設計，在前期單因素試驗探索的基礎上選取各因素的適宜條件范圍作為設計范圍，結果見表3。

表3 椰香型牡蠣肽飲料配方響應面優化設計的因素和水平Table 3 Factors and level of response surface optimization design of coconut-flavored oyster peptide beverage formula

2 結果與分析

2.1 牡蠣肽的脫色

采用粉末活性炭、顆粒活性炭和硅藻土3種脫色劑對牡蠣肽進行脫色的結果如圖1所示。

由圖1可知，在脫色劑用量、時間、溫度等條件一致時，粉末活性炭、顆粒活性炭和硅藻土3種脫色劑對牡蠣肽都有一定的脫色效果。其中，粉末活性炭脫色率最高，硅藻土的脫色率最低；同時，3種脫色劑的多肽回收率相差不大，均達到90%以上。因此，本研究選用粉末活性炭作為脫色劑，根據參考文獻[12]稍作改進得到脫色最佳條件為：粉末活性炭添加量為1.5 g/100 mL，40℃下磁力攪拌脫色40 min，離心取上清液抽濾，脫色率為54.59%，多肽回收率為85.28%。

圖1 不同脫色劑對牡蠣肽脫色效果的影響Fig.1 Influence of different bleaching agent on decoloring of the oyster peptide

粉末活性炭比表面積大，能吸附分子直徑小的有色物質，從而起到脫色作用[16]。其具有高效能、快速吸附蛋白質酶解液中的色素的作用，同時也具有一定的脫腥作用。

2.2 牡蠣肽的脫腥

對牡蠣肽進行脫腥處理，以姜粉和羅漢果粉進行單因素試驗，以感官值為評價指標，結果如表4所示。

表4 姜粉和羅漢果粉的感官評價Table 4 Sensory evaluation of ginger powder and grosvenor powder

由表4可知，牡蠣肽溶液中添加0.05%的羅漢果粉的脫腥效果優于其他組分，其能夠有效去除腥味且具有羅漢果的清香，故使用0.05%的羅漢果對清香型牡蠣肽飲料進行脫腥處理。

羅漢果是我國衛生部和中醫藥管理局批準的第1批藥食同源植物，同時其也作為最佳的天然甜味劑被廣泛應用[17]。羅漢果的營養價值主要包括醫藥價值和食療價值。醫藥價值主要有潤腸肺、止咳、緩解便秘，同時還具有加強抵抗力、抗氧化、保肝、預防致齲、糖尿病治療、抗菌、抗腫瘤和抗疲勞等新型藥學作用[18]。羅漢果的食療價值依附于其藥理功能，具體表現為羅漢果味甘、歸肺，通過煎湯，沸水浸泡食用，可緩解肺熱咳嗽、咽喉痛或失音、大便秘結等癥狀。綜上所述，羅漢果粉在清香型牡蠣肽飲料中不僅具有脫腥效果，同時還作為天然甜味劑和生物活性因子。

2.3 牡蠣肽飲料穩定劑的確定

復合蛋白飲料的穩定機理較為復雜，影響因素較多，如：膠體顆粒的總位能、沉降速度、pH值、電解質、增稠劑和穩定劑等。CMC-Na是一種纖維素衍生物，也是最主要的離子型纖維素膠，具有黏合、增稠等作用，廣泛應用于食品加工中。CMC-Na可與某些蛋白質發生溶膠作用，從而提高蛋白質的溶解度。添加食用CMC-Na能降低食品生產成本，改善口感，延長保質期[19-20]。果膠屬于天然食物，是一種安全無毒的天然食品添加劑，無每日允許攝入量（acceptable daily intake，ADI）限制。其也具有很多功能，如膠凝劑、穩定劑、組織形成劑、乳化劑和增稠劑，并廣泛應用于食品工業中；果膠也是一種水溶性的膳食纖維，具有增強胃腸蠕動，促進營養吸收的功能，對防治腹瀉、腸癌、糖尿病、肥胖癥等病癥有較好的療效，是一種優良的藥物制劑基質[21]。目前，在國內藥品和保健品中已有使用果膠的產品。

將CMC-Na與果膠進行正交試驗，以懸浮穩定性為評價指標，結果見表5。

表5 牡蠣肽飲料穩定劑配方正交試驗優化表L9（34）Table 5 Optimum formula of oyster peptide beverage stabilizer by an orthogonal test of L9（34）

由表5可知，復合型穩定劑加入飲料后提高了飲料的穩定性，黏度也得到一定程度的加強，改善了飲料的口感。但加入的量過多反而影響飲料的色澤，并帶來一定量的沉淀，影響品質。因此，最佳復合型穩定劑的添加量分別為CMC-Na 0.05%、果膠0.01%。

2.4 清香型牡蠣肽飲料最佳配方確定

通過正交試驗，由10位師生（5男5女）對產品進行感官評價，得出綜合平均感官得分，并通過極差分析，得出各因素對試驗結果的影響大小順序為A>D>B>C，見表 6。

表6 清香型牡蠣肽飲料配方L9（34）正交試驗水平表Table 6Design of L9（34）orthogonal test on formula of refreshing fragrance oyster peptide beverage

清香型牡蠣肽飲料各因素添加量最佳組合為A3B2C3D3，即：蔗糖7.0%、甜菊糖苷0.8%、水蜜桃粉2.0%和薄荷香精0.2%。為了驗證方案的準確性，在此條件下進行驗證試驗，其感官評價值為82.0，優于各試驗組，因此A3B2C3D3組合為最佳配方。最終得出清香型牡蠣肽飲料的配方為牡蠣肽粉3%，蔗糖7%，甜菊糖苷0.8%，三氯蔗糖0.006%，水蜜桃粉2%，羅漢果粉0.05%，薄荷香精0.2%，CMC-Na 0.05%，果膠0.01%。

2.5 椰香型牡蠣肽飲料最佳配方確定

2.5.1 單因素試驗

牡蠣肽分別加入椰漿粉（5%、10%、15%）、豆粉（5%、10%、15%）、奶粉（5%、10%、15%）、杏仁粉（5%、10%、15%）、植脂末（5%、10%、15%）和米湯水進行單因素試驗，發現加入椰漿粉的組別其色澤最佳，呈乳白色，且風味良好，無異味，有椰子清香。故選擇椰漿粉作為椰香型牡蠣肽飲料的輔料。

2.5.2 響應面優化試驗

根據單因素試驗結果，以牡蠣肽（A）、蔗糖（B）、甜菊糖苷（C）椰漿粉（D）為自變量，感官評分（Y）為因變量進行響應面試驗，Box-Benhken試驗設計及結果見表7和表8。采用Design-expert 8.0軟件對表8數據進行二次回歸方程擬合，得到感官評分（Y）對牡蠣肽（A）、蔗糖（B）、甜菊糖苷（C）及椰漿粉（D）的二次多項回歸方程：

Y=78.00-1.22A+2.96B-3.98C+0.24D+0.25AB+198AC+1.86AD+10.63BC-16.75BD-2.33CD-1.15A2-14.16B2-0.98C2-12.26D2

表7 椰香型牡蠣肽飲料配方Box-Benhken試驗設計及結果Table 7 Box-Benhken test design and results of coconut-flavored oyster peptide beverage formula

表8 回歸模型方差分析Table 8 Variance analysis of the regression model

由表 8 可知，P=0.003 0＜0.01，表明模型極顯著，F=16.48，表明模型顯著。回歸模型的決定系數R2=0.98，Adj R2=0.92，說明該模型能夠較好地描述試驗結果。

2.5.3 各因素響應面交互作用分析

采用Design Expert 8.0軟件對影響椰香型牡蠣肽飲料的4個因素進行交互分析，結果見表8和圖2。

圖2 牡蠣肽、蔗糖、甜菊糖苷和椰漿粉交互因子的相互作用對感官值的響應面圖Fig.2 The interaction of oyster peptide,sucrose,steviol glycoside and coconut cream powder to the response surface of sensory value

由表8和圖2可知，牡蠣肽、蔗糖、甜菊糖苷和椰漿粉對椰香型牡蠣肽飲料感官分值的影響趨勢為具有最高點的拋物線和上升的圓滑曲面。

2.5.4 最佳配方

采用Design Expert 8.0軟件的最優化功能設定因變量感官分值的變化范圍，從隨機組合開始最陡爬坡試驗，直到目標響應值。對預測配方進行驗證并根據實際感官評分稍作調整，最終得到椰香型牡蠣肽飲料配方：牡蠣肽3%，蔗糖5%，甜菊糖苷0.48%，椰漿粉10%，三氯蔗糖0.006%，CMC-Na 0.05%，果膠0.01%。

2.6 牡蠣肽飲料品質評價

2.6.1 感官指標

清香型牡蠣肽飲料晶瑩透亮，成柔和的金黃色，無腥味有淡淡的清香，外觀澄清，無沉淀，滋味純正，酸甜適中，口感柔和細膩；椰香型牡蠣肽飲料色澤乳白均一，無腥味，具有椰香，甜度適中，口感細膩，無后味。

2.6.2 理化指標

牡蠣肽飲料清香型和椰香型總糖含量分別為6.5 g/100mL、7.3 g/100mL，其蛋白質含量 1.53 g/100 mL和3 g/100 mL。牡蠣肽飲料氨基酸組成分析如表9所示，牡蠣肽飲料清香型和椰香型水解氨基酸含量分別為1.09%、1.65%。清香型牡蠣肽飲料中必需氨基酸/總氨基酸（essential amino acid/total amino acids，EAA/TAA）為37.62%，略低于蛋白質理想模式（EAA/TAA≈40%），必需氨基酸/非必需氨基酸（essential amino acid/nonessential amino acid,EAA/NEAA）為67.69%高于蛋白質理想模式（EAA/NEAA≥60%）；椰香型牡蠣肽飲料中 EAA/TAA為78.79%，EAA/NEAA為 371.43%，這兩個比值明顯高于聯合國糧農組織和世界衛生組織推薦的理想蛋白質模式，說明椰香型牡蠣肽飲料比清香型牡蠣肽飲料更符合蛋白質理想模式。這兩款果香型牡蠣肽飲料氨基酸含量豐富、種類齊全，氨基酸比例較均衡，具有較好的開發前景。

對貝類滋味影響較大的呈味氨基酸有谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸和脯氨酸[22]。牡蠣肽飲料呈味氨基酸含量較高，清香型和椰香型分別為：50.46%、49.09%。谷氨酸、天冬氨酸為呈鮮味的特征性氨基酸[23]，在清香型和椰香型牡蠣肽中含量較高，清香型為0.12%和0.16%，椰香型為0.14%和0.32%。支鏈氨基酸是主要的供能氨基酸，其氧化供能約占氨基酸供能總量的60%[24]。有研究表明支鏈氨基酸有助于消除疲勞，提高運動能力及加速肌肉合成[25-27]。同時，其還具有調節泌乳[28]和蛋白質代謝[29]、免疫調節[30]等生物活性。清香型和椰香型牡蠣肽飲料支鏈氨基酸含量分別為18.35%和20.61%。牡蠣肽飲料的氨基酸組成分析見表9。

表9 牡蠣肽飲料的氨基酸組成分析Table 9 Amino acid composition of the oyster peptide beverages%

2.6.3 微生物指標

牡蠣飲料清香型和椰香型的菌落總數分別為＜1 CFU/mL和60CFU/mL，大腸菌群含量均＜0.3MPN/mL，沙門氏菌和金黃色葡萄球菌未檢出，符合GB 7101-2015《食品安全國家標準飲料》和GB 29921-2013《食品安全國家標準食品中致病菌限量》中飲料的微生物和致病菌限量標準。

3 結論

本研究以牡蠣肽為原料，通過脫色、脫腥、調配、均質等工藝調配兩款果香型營養保健飲料。清香型牡蠣肽飲料通過正交試驗確定了其最優配方，牡蠣肽3%，蔗糖7%，甜菊糖苷0.8%，三氯蔗糖0.006%，水蜜桃粉2%，羅漢果粉0.05%，薄荷香精0.2%，CMC-Na 0.05%，果膠0.01%，其顏色澄清透明，呈金黃色，無腥味，有水蜜桃清香味，清涼蘇爽，口感絲滑。椰香型牡蠣肽飲料利用響應面優化其工藝參數，通過驗證后得到最優配方：牡蠣肽3%，蔗糖5%，甜菊糖苷0.48%，椰漿粉10%，三氯蔗糖0.006%，CMC-Na 0.05%，果膠0.01%，其顏色呈乳白色，無沉淀，具有椰香味，口感細膩且風味良好，無腥味。