HS-SPME-GC-MS分析小黃姜精油及油樹脂揮發性香氣成分

張璐璐，吳建文，黎貴卿，劉慧勤，陸順忠，李秋庭，*

（1.廣西大學輕工與食品工程學院，廣西南寧530004；2.廣西壯族自治區林業科學研究院，廣西南寧530002）

西林小黃姜又名細肉姜、火姜，姜科屬植物，草本多年生單子葉植物姜的地下根莖，一種常見的香辛調味料和傳統中醫藥材[1-2]。其根、莖、皮、肉皆為淡黃色，肉質致密，姜香濃郁，辛辣味濃，益脾胃、除濕消痞、止咳祛痰的功效優良，辛辣與香味和藥效都優于大種生姜，故又被稱為“火姜”，是廣西百色市西林縣著名特產，已評為中國國家地理標志產品[3-4]。

姜油（ginger oils）是生姜的主要深加工產品，根據不同的提取方法和產品特性分為精油（essential oils）和油樹脂（oleoresin）兩大類，能充分反映生姜的感官特性及生物活性，不僅是食品工業的主要原料，還用于醫學和洗化用品的開發，另外作為終端消費品也有廣闊的市場前景[1，5-7]。

姜油的香氣由大量的活性香氣成分構成，通過刺激或者激活嗅覺器官，產生了各種各樣的香氣[8]，可以作為質量評價的理論依據，也決定著不同的開發前景，而且是加工工藝改良的重要依據[9]。頂空-固相微萃取（headspace solid phase micro-extraction，HS-SPME）作為香氣物質主要測定方法之一，具有裝置簡單，操作簡便、采樣快速、重現性良好和避免了非揮發成分對色譜柱的污染等優點，同時結合氣相色譜質譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）可將定性與定量于一體，已廣泛用于揮發性成分測定[10]。并且，近幾年研究發現其在研究葡萄籽油[11]、茶油[12]、蒜油[13]以及金槍魚油[14]等多種油樣的香氣方面也有很好的應用。而姜油關于此方面的研究較少，僅在2015年，劉娜等[15]采用HS-SPME探究不同產地姜油樹脂香氣，發現主要香氣成分均為莰烯、β-萜品烯、α-蒎烯、水芹烯和β-水芹烯，但是含量差別較大。

因此，本研究采用HS-SPME對小黃姜不同姜油的萃取條件進行單因素優化，并結合GC-MS技術手段定性定量，以期全面分析其揮發性香氣物質，為小黃姜的開發利用提供數據基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小黃姜干姜片：西林縣富源植物開發有限公司；無水乙醇、石油醚、無水硫酸鈉（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

MND-628多功能養生料理機：福到家；98-II-B電子調溫電熱套：天津市泰斯特儀器有限公司；RE-5299旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；萃取頭及手動進樣手柄：上海安譜實驗科技股份有限公司；Scion.TQ氣相色譜-質譜聯用儀：美國布魯克美國布魯克道爾頓公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料制備

精油：粉碎干姜過40目篩，稱取90 g，水蒸餾物料比1∶16（g/mL），提取至得油體積不再增加，收集上層澄清透明黃色精油，無水硫酸鈉干燥，4℃保存備用。

油樹脂：粉碎干姜過40目篩，稱取90 g，索氏提取料液比為1∶8（g/mL），分別使用石油醚在85℃、無水乙醇在95℃條件下提取至回流液無色透明，旋蒸濃縮（溫度50℃）至恒重，得石油醚提取的油樹脂和無水乙醇提取的油樹脂，4℃保存備用。

1.2.2 萃取針頭的老化

使用氣相質譜儀進樣口作為老化裝置，氦氣吹掃保持環境惰性，老化時間及溫度按照Supelco公司的推薦條件進行，85 μm PA，老化溫度28 0℃，老化時間0.5 h。50 μm DVB/CAR/PDMS，老化溫度 270 ℃，老化時間 1 h。100 μm PDMS，老化溫度 250℃，老化時間0.5 h。

1.2.3 樣品萃取

將樣品置于15 mL樣品瓶中聚四氟乙烯隔墊密封，使用老化后SPME萃取纖維頭在室溫（28℃）進行吸附，快速插入GC-MS進樣口250℃，解吸一段時間，進行GC-MS檢測分析。

1.2.4 萃取條件的優化

1.2.4.1 萃取頭的優化

分別稱取精油（gingeressentialoils，GEO）0.1500g、石油醚油樹脂（oleoresin extracted by petroleum ether，PEEO）、無水乙醇油樹脂（oleoresin extracted by absolute ethanol，AEEO）各 0.400 0 g于 15 mL 樣品瓶中，使用萃取頭（100μmPDMS、50/30μmDVB/CAR/PDMS、85μm PA）分別萃取精油2 min、油樹脂5 min，在進樣口解析3 min進行優化，優化指標為定性香氣成分的總峰面積和峰數。

1.2.4.2 萃取時間的優化

分別稱取精油0.150 0 g，油樹脂（PEEO、AEEO）0.400 0 g于15 mL樣品瓶中，使用確定的最佳萃取頭，分別萃取精油（2、3.5、5、6.5 min）和油樹脂（5、7.5、10、12.5 min），在進樣口解析3 min進行優化，優化指標為定性香氣成分的總峰面積和峰數。

1.2.4.3 解析時間的優化

分別稱取精油0.150 0 g，油樹脂（PEEO、AEEO）0.400 0 g于15 mL樣品瓶中，使用已確定最佳萃取頭和萃取時間，在進樣口解析（1、2、3、4 min）進行優化，優化指標為定性香氣成分的總峰面積和峰數。

1.2.5 氣相色譜-質譜條件

1.2.5.1 氣相色譜條件

色譜柱：BR-5ms（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：初始溫度50℃保持1 min，以3℃/min升至150℃，保持2 min；再以20℃/min升至250℃，保持2 min；載氣為氦氣，流量 1.20 mL/min，壓力 2.4 kPa；分流比10∶1；進樣口溫度250℃。

1.2.5.2 質譜條件

電離方式EI，電子能量70 eV，傳輸線溫度250℃，離子源溫度230℃，質量掃描范圍30 m/z～550 m/z，掃描間隔1 s。

1.3 數據處理

定性分析：通過與NIST11譜庫進行檢索，要求正、反匹配度都大于800給予確認作為定性結果。定量分析：面積歸一化法。

2 結果與分析

2.1 萃取頭的優化

萃取頭是影響HS-SPME效果的最大因素。不同材料、不同厚度涂層的萃取頭，極性存在差異，萃取結果也明顯不同[16]。研究表明，精油主要由單萜和倍半萜烯組成，油樹脂除精油成分還含有姜酚，姜烯酚和姜油酮等酚類物質[17-18]。因此，試驗選取100μmPDMS（小分子揮發性非極性物質），50 μm DVB/CAR/PDMS（C3～C6大范圍分析），85μmPA（極性半揮發物質，酚類）萃取頭進行優化。不同萃取頭對HS-SPME萃取效果的影響見表1。

表1 不同萃取頭對HS-SPME萃取效果的影響Table 1 Extraction efficiencies of HS-SPME with different SPME fibers

結果如表1所示，可以看出不同的萃取頭對姜油萃取效果差別顯著。萃取頭100 μm PDMS萃取精油和油樹脂所得物質總峰面積最大，種類數最多，萃取效果明顯高于另兩種萃取頭，這與shao等[19]的研究結果相一致。因此，選取100 μm PDMS作為后續試驗的萃取頭進行優化。

2.2 萃取時間的優化

HS-SPME分析揮發性有機物時，萃取平衡所需時間較短，10 min之內一般可達最高吸附量；分析復雜基質及半揮發性有機物時，30 min至60 min才能達到平衡[20]。姜油屬濃縮成品，風味濃郁，在前期試驗基礎上，在參數優化基礎上，萃取時間分別設定為精油：2、3.5、5、6.5 min，油樹脂：5、7.5、10、12.5 min 進行優化。萃取時間對HS-SPME萃取效果的影響見圖1。

圖1 萃取時間對HS-SPME萃取效果的影響Fig.1 Extraction efficiencies of HS-SPME with different extraction time

結果如圖1A所示，隨著吸附時間的增長，GEO的總峰面積先增加后減少，但有效峰個數在增加后出現波動。可見延長吸附時間，有利于達到萃取平衡，但時間過長，萃取柱吸附已經達到飽和，樣品瓶中大量的低沸點物質競爭吸附會導致高沸點低含量的物質所占百分比發生變化，使總峰面積和有效峰個數出現波動。對比3.5 min與6.5 min的物質發現，6.5 min多吸附的3種物質含量極低，僅稍大于0.1%，但因為時間的增長導致一些對姜風味起重要作用的物質含量降低。又經單因素方差分析發現，2 min的總峰面積與3.5 min的存在極顯著差異（P＜0.01），與6.5 min的存在顯著差異（P＜0.05）。綜合考慮，確定3.5 min為最佳吸附時間。

如圖1B所示，隨著吸附時間的增長，PEEO總峰面積不斷增加，有效峰個數先增加然后保持不變。經單因素方差分析發現僅7.5 min與10 min的總峰面積存在顯著差異（P＜0.05）。考慮到7.5 min時峰型分離的更好，有利于物質定量。因此，確定7.5 min為最佳吸附時間。

如圖1C所示，隨著吸附時間的增長，AEEO總峰面積先增加后減少，有效峰個數先增加然后保持不變。可能由于萃取柱吸附達到飽和，延長一定的吸附時間，揮發物重新達到平衡過程時總峰面積會稍有波動。經單因素方差分析發現吸附時間改變，僅5 min的總峰面積與12.5 min的存在顯著差異（P＜0.05）。考慮到7.5 min峰數已達最大，峰型分離的更好，有利于物質定量。因此，確定7.5 min為最佳吸附時間。

2.3 解析時間的優化結果

在HS-SPME萃取富集完成后，萃取頭需要在GC進樣口解吸進樣。當進樣口溫度一定時，解吸時間過長，可能會破壞萃取頭的涂層材料，大大縮短使用壽命。反之解析時間過短，則不能完全解吸，不僅會降低GC-MS分析結果準確性，還可能污染萃取頭影響后續試驗[21-22]。因此，在優化參數基礎上，對不同解吸時間1、2、3、4 min 進行優化。

經研究發現在不同的解析時間條件下，姜油的峰數均未發生改變，GEO、PEEO和AEEO的峰數分別為44、41、44。而解析時間對總峰面積影響較大，如圖2所示。GEO的總峰面積在1 min～3 min內一直處于上升趨勢，4 min時有所降低，證明3 min時已基本解吸完全，因此，確定3 min作為精油的最佳解析時間。PEEO和AEEO的總峰面積，在2 min之前隨時間的增加而增加，2 min后緩慢下降。因此，確定2 min作為油樹脂最佳解吸時間。

圖2 解析時間對HS-SPME萃取效果的影響Fig.2 Extraction efficiencies of HS-SPME with desorption time

2.4 姜油揮發性成分的分析鑒定

最佳萃取條件下3種姜油的總離子流圖，如圖3所示。

圖3 姜油揮發性香氣成分的HS-SPME-GC-MS總離子流圖Fig.3 GC-MS total ion current chromatogram of aroma volatiles extracted from ginger oil by HS-SPME

由圖3可以看出，在最佳條件下，姜油揮發性香氣成分分離度好、峰型尖銳、對稱性好、無過飽和狀態。

在不同姜油中，同種香氣成分出峰時間差異不大，組成和含量存在顯著差異，對其進行檢索并計算相對百分含量，匯總結果如表2所示。

表2 姜油揮發性香氣成分的鑒定結果及相對百分含量Table 2 Volatile aroma compounds and relative content from ginger oil

續表2 姜油揮發性香氣成分的鑒定結果及相對百分含量Continue table 2 Volatile aroma compounds and relative content from ginger oil

由表2可知，GEO共鑒定出44種揮發性香氣成分，其中萜烴類20種（77.98%），酯類3種（0.70%），酮類6種（2.17%），醛類4種（10.93%），醇類11種（8.22%），主要為β-水芹烯（24.72%）、α-蒎烯（22.28%）、莰烯（10.95%）、α-檸檬醛（5.56%）、β-檸檬醛（4.99%）、月桂烯（4.81%）、姜烯（4.67%）等。PEEO共鑒定出41種香氣成分，其中萜烴類22種（77.64%），酯類3種（0.71%），酮類5種（1.43%），醛類 3種（4.71%），醇類 8種（15.52%），主要為 β-水芹烯（18.44%）、姜烯（18.40%）、莰烯（15.48%）、桉葉油醇（11.81%）、α-蒎烯（5.32%）、β-倍半水芹烯（4.37%）等。AEEO共鑒定出44種香氣成分，其中萜烴類25種（74.88%），酯類4種（1.26%），酮類3種（1.06%），醛類3種（3.13%），醇類9種（19.68%）主要為姜烯（32.51%）、桉葉油醇（14.52%）、β-水芹烯（10.20%）、β-倍半水芹烯（8.00%）、α-姜黃烯（5.53%）、β-紅沒藥烯（4.79%）、（E，E）-α-法呢烯（4.46%）等。

不同姜油的揮發性香氣成分存在一定差異。其中，GEO中未檢測到油樹脂中的δ-欖香烯、乙酸香茅酯、（+）-香橙烯、香柑油烯，β-法呢烯等12種香氣成分，而大量研究表明姜精油含有這些成分[23-24]，經分析這些成分集中在GC-MS出峰靠后的時間段，因此，這可能與成分的含量、揮發性以及萃取頭的萃取平衡等因素相關。而三環烯、α-蒎烯、甲基庚烯酮等12種香氣成分均只在其中一種油樹脂中檢測到，可能與兩種溶劑極性差別有關。此外，姜辣素類物質是油樹脂主要成分，使其呈現特征辛辣風味，但是在PEEO、AEEO頂空固相微萃取的整個優化過程中均未檢測到，這與文獻中姜酚、姜烯酚沸點高不具有揮發性相一致[25-27]。

3 結論

本研究采用HS-SPME以總峰面積和峰數為優化指標對萃取頭、萃取時間和解析時間進行優化，確立常溫下萃取小黃姜3種姜油香氣成分最佳條件為：GEO0.1500g，采用100μmPDMS萃取頭，萃取3.5min，解析 3 min；PEEO、AEEO 均為 0.400 0 g，采用 100 μm PDMS萃取頭，萃取7.5 min，解析2 min。最佳條件下GEO、PEEO、AEEO 分別測定出 44、41、44 種香氣成分，含量最高的物質均為萜烴類，也含有少量酯、酮、醛和醇。3種姜油在組成和含量均具有一定差異，使得呈香各具特色。其中GEO主要為β-水芹烯、α-蒎烯、莰烯、α-檸檬醛、β-檸檬醛、月桂烯、姜烯等；PEEO 主要為 β-水芹烯、姜烯、莰烯、桉葉油醇、α-蒎烯、β-倍半水芹烯等；AEEO主要為姜烯、桉葉油醇、β-水芹烯、β-倍半水芹烯、α-姜黃烯、β-紅沒藥烯、（E，E）-α-法呢烯等。