以脾胃為中心的葛根相關配伍對糖尿病心肌病大鼠受損心肌線粒體的改善作用*

樊一波，文穎娟，李 蒙，李 靜，朱瑞超

1.陜西中醫藥大學(咸陽712046)；2.寶雞職業技術學院(寶雞 721013)

糖尿病心肌病(Diabetic cardio myopathy，DCM)作為糖尿病并發癥之一，已成為糖尿病患者最主要的死亡原因[1-2]，目前西方醫學對DCM的治療，用藥體系繁雜，這可能與其眾說紛紜的藥物治療靶點有關[3-6]。因此深入探討DCM治療機制便顯得尤為重要，中醫學中并沒有與DCM相關的記載，但依據其臨床表現，發現其與“消渴”“心悸”“胸痹”“胸痛”“真心痛”等具有一定的相似性。而對于以上病癥，在中醫學中卻記載頗多，并發現這些病癥存在一定的關聯性，同時認為脾胃是對其進行治療的關鍵。仝小林教授在長期的臨證中對此點進行了印證，認為糖尿病的病理中心在于“胃腸”，糖尿病日久，至疾病晚期，最終由于脾胃虛憊，氣血生化乏源，而使并發癥叢生[7-8]。同時有文獻記載線粒體遍布人體各有氧真核細胞當中，若其結構、功能失常，便會導致人體能量代謝失常，以致影響人體五臟六腑及生命體的正常生理功能，此功能與脾相似度極高，研究發現線粒體的氧化磷酸化產能過程與脾運化功能高度相似[9-10]。由此可見，DCM的發生、治療可能與線粒體質量關系密切，這與近年來西方醫學的相關研究結論不謀而合[11-12]，故認為線粒體質量與DCM存在一定關系，線粒體質量直接影響了DCM的發生發展。因此本次實驗以脾胃為中心，研究中醫組方對DCM心肌線粒體質量的調控作用，以深入探討DCM的治療機制，并通過拆方揭示中醫治療DCM的科學內涵。

材料與方法

1 實驗藥物 葛根方：葛根10 g；葛芪方：葛根10 g、黃芪 15 g；葛參方：葛根10 g、丹參15 g；葛根與瓜蔞薤白半夏湯組成的葛蔞方：葛根10 g，薤白9 g，全瓜蔞、半夏各12 g；葛根與黃芪、丹參、瓜蔞薤白半夏湯配伍組成的葛芪參蔞方：葛根10 g，黃芪、丹參各15 g，薤白9 g，全瓜蔞、半夏各12 g。以上藥物均購于陜西中醫藥大學第一附屬醫院。藥物用量參照高學敏主編《中藥學》、鄧中甲主編《方劑學》以及相關文獻[13]。上述中藥按常規煎法，每方每服煎取原藥液600 ml，后分別濃縮為50 ml的相應濃縮液。對照組則選取達美康，動物灌胃時以150 mg達美康粉末，溶于50 ml純水中，制成3 mg/ml的達美康混懸液備用。

2 主要實驗試劑、儀器

2.1 實驗試劑：鏈脲佐菌素(Streptozoto-cin,STZ )溶液(S8050)、檸檬酸鈉緩沖液(C1032)，戊二醛溶液(P1126)、羅丹明123(R8030)購于北京索萊寶科技有限公司(Solarbio)；812環氧樹脂包埋套裝(GP18010)、醋酸雙氧鈾(GS02624)、檸檬酸鉛染液(GZ02616)購于北京中鏡科儀技術有限公司；四氧化鋨(徠卡，GP18456)ATP Elisa試劑盒由上海茁彩生物科技有限公司生產；無水乙醇、二甲苯生產于成都科龍化工試劑廠；PBS磷酸鹽緩沖液(北京中杉金橋生物技術有限公司，ZLI-9062)。

2.2 實驗儀器：酶標儀(賽默飛世爾儀器有限公司生產，Multlskan Mk3)由陜西中醫藥大學實驗室提供；超薄切片機(LabX，Reichert-Jung)；透射電子顯微鏡(日本日立，H-600IV)；流式細胞儀(美國碧迪公司，FACSCalibur)；離心機(中佳，KDC-40)。

3 實驗動物 8周齡SPF級雄性SD大鼠90只，體重(200±20)g，均購于西安交通大學動物試驗中心，動物質量合格證號：SCXK(陜)2017-003。

4 實驗方法

4.1 造模、分組方法：新購動物于濕度40%～60%，溫度22oC～26oC環境下適應性飼養1周后，逐一稱取體重，平均(213.21±23.51)g，并隨機選取10只為空白組，剩余80只為模型組。模型組大鼠以高脂高糖飼料喂養4周后，禁食12 h，一次性腹腔注射STZ溶液50 mg/kg，選取連續兩次血糖監測值均≥16.7 mmol/L的模型大鼠(兩次檢測時間間隔3 d)，繼續飼養4周形成DCM模型[14-15]。然后將成模大鼠隨機分為：模型組、達美康組、葛根組、葛芪組、葛參組、葛蔞組、葛芪參蔞組各8只。空白組選取未做造模處理大鼠8只。

4.2 給藥方法:各組大鼠均以灌胃給藥。給藥劑量參照參照施新猷主編《現代醫學實驗動物學》進行換算，公式：(成人每日用藥量/60 kg)×6.25。則各組分別以其濃縮液給藥量為：達美康組16.7 mg/(kg·d)；葛根組1.04 g/(kg·d)；葛芪組2.6 g/(kg·d)；葛參組2.6 g/(kg·d)；葛蔞組4.48 g/(kg·d)；葛芪參蔞組7.6 g/(kg·d)；模型組、空白組大鼠則以生理鹽水6.5 g/(kg·d)進行灌胃。每組在給藥期間均以普通飼料喂養，持續9周。

5 指標檢測

5.1 心肌線粒體超微結構檢測：各組大鼠經藥物治療后，取大鼠心肌組織，依次經過固定、脫水、滲透、包埋、加熱聚合、切片、染色后，通過投射電鏡觀察各組大鼠心肌線粒體結構，并進行比較。

5.2 心肌線粒體跨膜電位檢測：將收集好的心肌細胞用PBS緩沖液清洗2次，后使用Rhodaminel 23染液進行染色，染色后再使用PBS緩沖液清洗2次，而后以250 μl PBS重懸細胞并緩慢加入-20oC乙醇750 ml，使用流式細胞儀對其跨膜電位進行檢測并進行比較。

5.3 心肌細胞ATP濃度檢測：各組大鼠經藥物治療后，將大鼠心肌組織進行勻漿，取上清液以免疫酶聯法檢測各組大鼠心肌細胞ATP濃度進行比較。

6 統計學方法 實驗數據采用SPSS 22.0統計學軟件分析，數據分析結果以均數±標準差表示，其中計量資料采用單因素方差分析中的LSD法進行統計處理，組間數據對比采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義；線粒體超微結構采用描述性分析。

結 果

1 各組大鼠心肌線粒體超微結構比較 空白組心肌肌原纖維無損傷，細胞核均勻分布于心肌組織中，線粒體結構表達清晰，無腫脹，嵴結構完整，線粒體膜無損傷；模型組，部分肌原纖維溶解，心肌細胞核聚集，線粒體腫脹明顯，嵴有斷裂、溶解，部分線粒體膜損傷；經過藥物干預治療后，達美康組線粒體損傷減輕，嵴結構清晰，但仍有部分線粒體腫脹，嵴斷裂或溶解，線粒體膜損傷，肌原纖維受損；各中藥治療組之間，葛參組、葛芪參蔞組線粒體損傷程度均低于葛根組、葛芪組、葛蔞組三組，其線粒體結構完整，嵴結構清晰，但仍存在部分線粒體腫脹，嵴斷裂或溶解。其中以葛芪參蔞組線粒體損傷最低，且低于達美康組，表現為肌原纖維無明顯損傷，線粒體無明顯腫脹，嵴無明顯的斷裂或溶解，線粒體膜損傷減輕，心肌細胞核分布均勻(圖1)。

圖1 各組大鼠心肌線粒體超微結構

2 各組大鼠心肌線粒體跨膜電位比較 模型組大鼠線粒體跨膜電位熒光強度較空白組降低，波峰左移明顯；各治療組線粒體跨膜電位熒光強度與空白組、模型組比較，則可通過疊加圖直觀的展現，各治療組波峰均在模型組、空白組之間；各治療組中，葛芪參蔞組、葛參組、葛根組三組波峰位于達美康組右側；這三組中又以葛芪參蔞組波峰最接近空白組(圖2)。

圖2 各組大鼠心肌線粒體跨膜電位疊加圖

3 各組大鼠心肌細胞ATP濃度比較 見表1。各組較空白組，ATP濃度值顯著降低(P<0.05)；藥物干預后，達美康組、各中藥治療組ATP濃度值明顯高于模型組(P<0.05)；同時，中藥治療組中除葛芪參蔞組ATP濃度值明顯高于達美康組外(P<0.05)，其余各中藥治療組ATP濃度值與達美康組比較差異無統計學意義(P>0.05)；而各中藥治療組之間比較，葛芪參蔞組ATP濃度值明顯高于其余各中藥治療組(P<0.05)，其余各中藥治療組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠心肌細胞ATP濃度比較(nmol/L)

討 論

中醫認為，DCM與“消渴”“心悸”“胸痹”“胸痛”“真心痛”等癥相對應，而這些疾病之間又存在一定關聯，同時與脾胃關系密切。如《素問·奇病論》：“脾癉……此人必數食甘美而多肥也，肥者令人內熱，甘者令人中滿，故其氣上溢，轉為消渴”。明確指出了，脾胃與消渴發病關系密切。而張仲景、巢元方在其著作中均有“消渴”與“心痛”“胸痹”相關聯的描述，如《諸病源候論》中提到：“消渴重，心中痛”。因此“消渴”兼見“胸痹”“胸痛”“心痛”時可以脾胃為主進行治療，如《素問·經脈別論》中指出：“食氣入胃，濁氣歸心，淫精于脈”即心血充沛、心脈充盈來源于脾胃化生氣血，脾胃虛弱“四肢不用，五臟不安”，影響及心，終致“脾病不能為胃行其津液……氣日以衰，脈道不利……”癥見胸痹、心痛等，則為此類疾病的治療奠定了理論依據，張景岳則于《類經·疾病》中提到：“上虛而痛者，心脾受傷也，非補中不可”的治療方法，可見中醫認為DCM的關鍵病機是以脾氣虛弱為主而導致的津液代謝失常，氣血生化無源，氣無力推動血行而成痰濁、瘀血阻滯心脈最終發生胸痹、心痛等癥。

同時近年來有研究發現心肌細胞能量代謝異常及心肌細胞數量減少可能是導致糖尿病心肌病心臟功能受損的重要病理生理機制[16]。而線粒體功能障礙在糖尿病發生過程中起著關鍵作用[17]，高血糖引起線粒體功能損傷后導致線粒體能量代謝異常、ROS產生增加、啟動線粒體依賴性的凋亡途徑、線粒體的分裂和融合紊亂以及心磷脂含量及結構改變，又會引起糖尿病心肌病變。而究其功能的正常實現，主要依賴于線粒體膜流動性及線粒體膜通透性轉換的正常，二者在維持線粒體功能中起著關鍵作用[18]，可見線粒體功能正常與否與其結構完整息息相關。通過前文述及脾胃、線粒體、DCM之間存在一定關聯，因此我們以脾胃為中心，選定歸屬脾胃經藥物葛根，結合中醫對DCM病機認識，以益氣、化瘀、祛痰三法與葛根組成相關配伍，對模型大鼠心肌線粒體質量變化進行了觀察。

研究發現，DCM大鼠心肌線粒體存在一定程度的損傷，同時伴隨有膜電位降低，通過藥物干預后，損傷心肌線粒體都得到了不同程度的修復，膜電位有了不同程度的增加，心肌ATP濃度有所提升，而ATP水平的升高表明線粒體功能增強，能量供應充足，動能增加，細胞、組織運動能力加強[19]，可見以脾胃為中心的葛根相關配伍，能夠通過線粒體質量的正向調控，從而達到一定的治療目的。但單味葛根及以單一治法確立的葛根配伍對受損線粒體結構的修復、膜電位的正向調控均不及以益氣、化瘀、祛痰三法結合為組方原則的葛根配伍，可見益氣、化瘀、祛痰三法結合能夠更好的調節脾胃功能，使氣足、血行、邪祛，進而產生一定的協同增效作用。

綜上，線粒體結構的損傷在DCM的發生發展及治療中可能扮演著重要的角色，以脾胃為中心的葛根相關配伍可能是通過改善線粒體損傷結構，提高其功能，調控線粒體質量正向發展，進而達到治療DCM的作用，這與有關研究的結果不謀而合[20]。同時研究發現，以化瘀為原則進行的配伍，對線粒體質量正向調控優于以益氣、祛痰為原則進行的配伍，并且益氣、化瘀、祛痰三法結合具有一定的協同增效作用，可見，臨床治療中，可通過以脾胃為中心，益氣、化瘀、祛痰三法結合的組方原則進行藥物配伍治療，同時加重化瘀藥物使用比例，可能會取得更好的效果，這也可能是中醫治療DCM的科學內涵。但是就線粒體質量控制而言，本次研究僅僅涉及到線粒體結構、功能方面的研究，至于線粒體動態平衡(如線粒體自噬，線粒體分裂、融合)方面沒有涉及，那么以脾胃為中心，益氣、化瘀、祛痰三法結合的組方原則進行配伍的方劑，是否也能有效調控線粒體動態平衡，仍有待于進一步研究。