補腎活血復(fù)方對心肌梗死后心力衰竭大鼠CaMKⅡ的影響研究*

徐 瑤，張 艷，孔繁達(dá) ，張 偉

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)(沈陽 110847)；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(沈陽 110032)

慢性心衰近年來發(fā)病率明顯升高，在中國30～75歲的人群中，有近400萬人患有心力衰竭，5年內(nèi)死亡率超過65%，其中慢性心衰患者占主要比例[1]。神經(jīng)內(nèi)分泌激活加快心衰的進(jìn)程，心肌重構(gòu)是慢性心衰發(fā)生發(fā)展的基本機制，因此阻斷神經(jīng)內(nèi)分泌激活，抑制心肌重構(gòu)成為治療心衰的關(guān)鍵。多項研究證實β-腎上腺素能系統(tǒng)和α腎上腺系統(tǒng)可以通過增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度并與CaM結(jié)合，之后經(jīng)過活化CaMKⅡ，介導(dǎo)心肌肥厚和凋亡產(chǎn)生，致使心臟衰竭發(fā)生[2]。心肌細(xì)胞凋亡及心室重構(gòu)等信號通路均受到CaMKⅡ的調(diào)節(jié)。團隊前期大量研究證實補腎活血復(fù)方能降低心衰大鼠血漿OPN、Klotho蛋白水平，還能改善大鼠的癥狀和心肌細(xì)胞功能[3-4]。本次實驗將進(jìn)一步探討補腎活血復(fù)方對心梗后心衰大鼠心功能及心肌中CaMKⅡ表達(dá)的影響。

材料與方法

1 實驗材料

1.1 藥物:補益心腎中藥，主要成分為：黃精、坤草各20 g，桂枝、紅花各15 g，黃芪40 g，丹參30 g，人參10 g，三七5 g，選自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑中心煎制。卡托普利片：25 mg×100片，購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司(國藥準(zhǔn)字H31020564)。

1.2 動物:SPF級雄性Wister大鼠80只，體重(200±20)g，購買于遼寧長生生物技術(shù)有限公司，SCXK(遼)2015-0001。

1.3 動物飼養(yǎng)環(huán)境:溫度(23±2)℃，濕度適宜，明暗交替，噪聲<50分貝，定期飼喂飲水，墊料1周替換3次。

1.4 儀器設(shè)備與試劑盒：儀器設(shè)備有自動組織脫水機(河北慧采科技開發(fā)有限公司，型號RL078536KD-TS3D1)，切片機(日本日立公司，型號Leica RM2015)，攤烤片一體機(德國SLEE醫(yī)療有限公司，型號Slidetec WATER/HETA)，電熱恒溫箱(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)，顯微鏡(日本奧林巴斯公司，型號OlympusBX51)。

試劑盒：CaMK Ⅱ一抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)，二抗酶標(biāo)山羊抗小鼠/ IgG聚合物(北京中杉金橋)，蛋白酶K(Solarbio),DAB顯色試劑盒(脈新試劑)，Elisa試劑盒(英國Abcam公司，型號ab108816),二甲苯、酒精、蘇木素、PBS等。

2 實驗方法

2.1 慢性心衰大鼠造模:①大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機選出20只為假手術(shù)組，只掛線不結(jié)扎。剩余60只經(jīng)冠脈結(jié)扎，術(shù)后給予減食和力竭式游泳造模，隨機分為模型組、西藥組、中藥組。②在禁食和給水12 h后捕獲大鼠，并且腹膜內(nèi)注射10%水合氯醛(劑量0.3～0.5 ml/100 g)。麻醉后，將大鼠固定在手術(shù)臺上，準(zhǔn)備胸部皮膚，連接心電圖儀器，記錄大鼠術(shù)前心電圖。調(diào)整動物呼吸機數(shù)值，打開開關(guān)備用。大鼠經(jīng)喉氣管插管，氣道暢通后，接通小動物呼吸機。③穩(wěn)定呼吸后，大鼠接受開胸手術(shù)。碘酊消毒，在胸部第四肋間縱行開口，胸肌直接分離，鉤開肋間，用小鑷子撕裂心包膜，助手施力并抬高心臟使心臟完全顯露，用6號手術(shù)線在左冠狀動脈開口以下2 mm進(jìn)行結(jié)扎[5-6]，肋間隙等組織層用3號線迅速縫住，以結(jié)扎完ECG標(biāo)準(zhǔn)肢體二導(dǎo)聯(lián) ST 段抬升(≥0.1 mV)作為結(jié)扎成功的標(biāo)準(zhǔn)[7]。④大鼠腹腔注射青霉素鈉50000 U每天，連續(xù)7 d。存活大鼠常規(guī)飼養(yǎng)1周，第2周起飼料減到原喂養(yǎng)量一半，每天進(jìn)行一次力竭游泳(力竭標(biāo)準(zhǔn)以大鼠頭部持續(xù)沒入水里3 s以上，四肢無力活動)，持續(xù)4周。造模結(jié)束后，用彩色多普勒超聲心動圖檢查大鼠，射血分?jǐn)?shù)≤50%或心臟指數(shù)≤180 ml/(min·kg)，認(rèn)為造模成功[8-9]，本次實驗造模前后大鼠心臟彩超對比(圖1、2)。

圖1 大鼠造模前心臟彩超

圖2 大鼠造模后心臟彩超

2.2 分組與藥物治療:假手術(shù)組死亡3只，剩余17只。其余60只造模成功的37只,隨機分為西藥組(13只)，中藥組(12只)和模型組(12只)。正常、模型兩組大鼠不用藥，只灌服常規(guī)等體積蒸餾水，3 ml/次，每日1次；陽性藥物組參照人鼠劑量轉(zhuǎn)換公式用藥干預(yù)，西藥組卡托普利片灌服，12.5 mg/(kg·d)；中藥組大鼠灌服補腎活血復(fù)方制劑，劑量為9.2 g/(kg·d)(初步實驗顯示中藥制劑等效劑量效果最好，因此采用等效劑量換算)，連續(xù)用藥4周。

2.3 收取標(biāo)本:大鼠均麻醉，腹主動脈采血，處死取心臟固定。

酶聯(lián)免疫法測定大鼠血BNP表達(dá)：①設(shè)有樣本孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔及空白孔。樣本孔加入待測樣本10 μl后，再加其稀釋液40 μl；不同濃度的50 μl稀釋標(biāo)準(zhǔn)品加入標(biāo)準(zhǔn)品孔中；不添加空白孔；②將100 μl HRP標(biāo)記抗體分別加入樣品孔和標(biāo)準(zhǔn)樣品孔中，置37 ℃水浴中孵育60 min。丟棄孔中液體，輕拍吸水紙，向每個孔中加入洗滌液，靜置1 min，扔掉洗滌液，于吸水紙上輕拍，反復(fù)洗板5次；③在各孔中加入50 μl底物A和50 μl B，37 ℃遮光孵育15 min，最終滴入50 μl終止液，在15 min內(nèi)，于波長450 nm處測得各孔的OD值。

免疫組織化學(xué)法檢測大鼠心肌中CaMKⅡ的表達(dá)：①大鼠心肌標(biāo)本用4%多聚甲醛液固定，然后包埋于石蠟中并切片；②脫蠟后PBS沖洗，蛋白酶K進(jìn)行抗原修復(fù)，先后加入內(nèi)源性過氧化物酶及10%胎牛血清封閉，一抗培養(yǎng)過夜，用PBS洗滌，加入酶標(biāo)記的山羊抗小鼠或兔IgG聚合物，常溫孵育后，DAB染色，蘇木素復(fù)染，脫水透明后封片；③在切片中選取5個高倍視野，用Image J對視野灰度值進(jìn)行分析，并用平均值表示。

3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件來分析，測量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用單因素方差分析進(jìn)行比較，組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 四組大鼠一般情況對比 成模后，除假手術(shù)組，其余各組大鼠毛色暗沉、偶有脫毛，精神疲乏，運動量減少，飲食略差，體重下降，一些大鼠出現(xiàn)咳嗽、氣短的癥狀；給藥干預(yù)后，西藥組和中藥組大鼠毛色漸有光澤，精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)，活動、飲食、體重都出現(xiàn)增長，咳嗽氣短減輕。

2 四組大鼠心臟彩色多普勒超聲結(jié)果對比 見表1。治療4周后，與假手術(shù)組相較，模型組LVEDD、LVESD顯著升高，EF和FS均顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，西藥組、中藥組LVEDD、LVESD顯著降低，EF、FS顯著升高(P<0.05)；與西藥組相比，中藥組LVEDD、LVESD、 EF、FS比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 四組大鼠心臟彩色多普勒超聲結(jié)果對比

3 四組大鼠血清BNP水平比較 見表2。用藥4周后，與假手術(shù)組相比，模型組血清BNP表達(dá)水平顯著增高(P<0.05)；與模型組比較，中藥組和西藥組血清BNP表達(dá)水平明顯低于模型組(P<0.05)；與西藥組相比，中藥組血清BNP表達(dá)水平變化不顯著，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 四組大鼠血清BNP水平比較(ng/ml)

4 四組大鼠心肌組織CaMKⅡ平均灰度值比較見表3。用藥4周后與假手術(shù)組比較，模型組CaMKⅡ平均灰度值升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，中藥組、西藥心肌組織中CaMKⅡ平均灰度值降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與西藥組相較，CaMKⅡ平均灰度值在中藥組的表達(dá)相差不大，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3 四組大鼠心肌組織CaMKⅡ平均灰度值比較

討 論

慢性心衰為各種心血管疾病的終末階段，預(yù)后較差、致病死率較高，是我國醫(yī)學(xué)亟需解決的難題[10]。其實質(zhì)是神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞因子的長期、慢性激活導(dǎo)致心肌損傷及心功能惡化，進(jìn)一步加速心室重塑，而后者又可激活神經(jīng)內(nèi)分泌因子系統(tǒng)，形成惡性循環(huán)[11]。因此阻止神經(jīng)內(nèi)分泌激活與心室重構(gòu)的交替發(fā)生，是目前治療慢性心衰的關(guān)鍵[12]。

近年來，多項研究證實CaMKⅡ作用于多種信號通路的下游靶點，導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[13-14]。CaMKⅡ與心肌肥厚和心力衰竭密切相關(guān)。CaMKⅡ參與慢性心衰主要以抑制心肌重構(gòu)為關(guān)鍵。細(xì)胞內(nèi)Ca2+離子的穩(wěn)態(tài)與調(diào)節(jié)也受到其活性的影響。當(dāng)心肌長期損傷激活交感神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性，導(dǎo)致Ca2+釋放增加，與Cam(蛋白激酶)結(jié)合形成復(fù)合體，就會通過經(jīng)典Ca2+/Cam依賴途徑激活CaMKⅡ的活性，致使細(xì)胞凋亡和心力衰竭的發(fā)生。越來越多的研究表明CaMKⅡ抑制有利于改善心肌功能。因此，CaMKⅡ活性的調(diào)節(jié)對于治療心力衰竭的發(fā)展至關(guān)重要[15]。

祖國醫(yī)學(xué)對于慢性心衰的認(rèn)識主要從心腎論治。中醫(yī)認(rèn)為心主血脈，腎主藏精，精血同源，相互滋生，精神互用，君相安位[16]。如果心腎功能失衡，就會相互累及，久而久之，心血運行不暢，腎化氣利濕失職，血瘀、痰飲內(nèi)滯，脈道阻塞，發(fā)生心衰[17]。補腎活血復(fù)方主要功效為補腎益精、活血利尿，是導(dǎo)師張艷教授臨床辨治慢性心衰經(jīng)驗方[18]。其中黃精補腎氣，益精髓，桂枝溫經(jīng)助陽通脈，黃芪、人參、坤草三味補氣血、利水行，丹參、紅花、三七活血散瘀，諸藥共同發(fā)揮補腎益精、活血行水、心腎同治的作用。

本實驗應(yīng)用補腎活血復(fù)方對慢性心衰大鼠進(jìn)行干預(yù)，同時觀察對其心功能及CaMKⅡ表達(dá)的影響，結(jié)果顯示補腎活血復(fù)方能顯著升高EF及FS，降低LVEDD、LVESD，改善心功能，且有效抑制心衰大鼠心肌中CaMKⅡ的表達(dá)含量，與西藥組相較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明補腎活血中藥治療心力衰竭的療效與卡托普利相當(dāng)，提示補腎活血復(fù)方能有效治療心衰。證明以心腎相關(guān)理論干預(yù)慢性心衰方向明確，為中醫(yī)藥治療慢性心衰以CaMKⅡ作為新靶點提供依據(jù)。