3-取代吲哚酮類抗癌藥物對抗神經退行性疾病之進展

黃 凌，張在軍，李銘源，韓怡凡，崔 巍

(1. 寧波市康寧醫院精神科，寧波大學醫學院，浙江 寧波 315020；2. 暨南大學新藥研究院，廣東 廣州 510632；3. 澳門大學中華醫藥研究院，澳門 999078；4. 香港理工大學應用生物與化學技術學系，香港 999077)

隨著人口老齡化的進程，神經退行性疾病已成為繼心腦血管疾病、惡性腫瘤之后的第三大殺手，但是，對癥治療神經退行性疾病的藥物尚未面世。目前臨床使用的治療藥物雖能減輕神經退行性疾病癥狀，但無法阻止神經元死亡。因此，急需研發能夠減慢或阻止疾病進程的神經保護藥物。

最近研究發現，許多腫瘤和神經退行性疾病具有相似的特征，如都是隨著年齡增長，發病率上升的疾病，最近發現膠質母細胞瘤、前列腺癌等患者罹患阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease，AD)的比例更高，提示機體的某些信號通路可能同時對腫瘤細胞和神經元有調控作用[1]。這使人們思考抗腫瘤藥物可否通過調節這些共有的信號通路阻止神經退行性疾病[2]。研究發現臨床治療慢性髓性白血病和惡性胃腸道間質腫瘤的Abl激酶抑制劑甲磺酸伊馬替尼可有效抑制線粒體功能障礙，阻止神經毒性蛋白β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)產生，因此可能“老藥新用” 治療AD[3]。

3-取代吲哚酮類化合物也兼具抗腫瘤和抗神經退行性疾病藥效。3-取代吲哚酮類化合物是含有吲哚-2酮母核結構的雜環類化合物。1998年，SUGEN公司設計、合成了舒尼替尼、SU4312、SU5416等系列3-取代吲哚-2-酮類化合物。這些化合物可競爭性結合多種受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)的ATP結合位點，進而抑制RTK的功能。由于包括血管內皮生長因子受體-2、血小板衍化生長因子受體在內的多個RTK介導了腫瘤相關信號通路，因此3-取代吲哚-2-酮類化合物可通過特異性抑制這些受體，阻止腫瘤生長和血管新生，殺死腫瘤細胞。2006年，舒尼替尼被美國食品藥品管理局批準用于臨床治療腎細胞癌和胃腸間質瘤，是首個被批準用于治療兩種以上癌癥的藥物。SU4312、SU5416等也已進入腫瘤治療的臨床實驗。合成的3-取代吲哚酮類化合物還包括SU6668、GW5074等，但這些化合物由于特異性差、副作用強等原因未能進入臨床癌癥治療。

有趣的是，多種天然產物也具有3-取代吲哚-2-酮結構。上世紀七十年代，中國醫學科學院血液學研究所從青黛中提取了3-取代吲哚酮類天然產物——靛玉紅。靛玉紅有很強的新生血管抑制活性，能抑制腫瘤生長，現已被中國藥監局批準用于治療慢性粒細胞白血病。近年來，許多靛玉紅衍生物如靛玉紅-3-肟、7-溴-靛玉紅-3-肟也顯示了良好的抗腫瘤效果，進入臨床或臨床前實驗(Fig 1)。本文嘗試從機制上探討3-取代吲哚酮類化合物對抗神經退行性疾病的分子靶標和作用機理，并展望了這類化合物“老藥新用”對抗神經退行性疾病的可能性。

1 3-取代吲哚酮類化合物具有神經保護活性，可能對抗神經退行性疾病

神經退行性疾病包括帕金森病(Parkinson’s disease，PD)、AD、亨廷頓病和肌萎縮側索硬化癥等。這些疾病的主要特征是大腦和脊髓神經元病理性喪失。由于神經元難以再生，因此神經損傷很難被逆轉，損傷后可能導致神經系統漸進性功能障礙。神經退行性疾病的病因尚不清楚。一般認為多個靶點聯合參與疾病發生發展：如遺傳、環境等多種因素通過氧化應激、線粒體損傷、異常蛋白聚集等多種機制導致PD患者中腦多巴胺能神經元退行性死亡，隨著多巴胺能神經元減少，患者出現靜止性震顫、肌肉僵直、行動遲緩等運動障礙[4]。AD病因假說包括Aβ毒性假說、tau蛋白過度磷酸化假說、膽堿能下降假說等[5]。隨著病程進展，AD患者大腦膽堿能神經元退行性丟失，出現漸進性記憶障礙、認知功能障礙、人格改變及語言障礙等癥狀[6]。

Tab 1 The neuroprotective mechanisms of 3-substitute indolines in treating neurodegenerative disorders

Fig 1 Chemical structures of representative 3-substitute indulines

近年來，包括我們的多個課題組分別獨立發現，3-取代吲哚酮類化合物在體外培養神經元有顯著神經保護作用。舒尼替尼、SU4312、SU5416在體外培養的SH-SY5Y細胞和小腦顆粒神經元能阻止1-甲基-4苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridinium ion，MPP+)誘導的神經元凋亡[7]；舒尼替尼、GW5074可對抗撤鉀引起的小腦顆粒神經元凋亡[8]；靛玉紅-3-肟在PC12細胞能抑制6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)誘導的神經元死亡[9]。靛玉紅-3-肟、7-溴-靛玉紅-3-肟和舒尼替尼還能在SH-SY5Y細胞、小膠質細胞阻止Aβ誘導的細胞損傷。此外，藥代動力學數據顯示3-取代吲哚酮類化合物可以穿過血腦屏障，提示這些化合物可能有中樞神經系統藥理活性。

3-取代吲哚酮類化合物在多種神經退行性疾病動物模型中也顯示了極強的神經保護活性，阻止運動障礙和認知損傷。SU4312、SU5416在斑馬魚中可抑制1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP)誘導的運動障礙和中腦多巴胺能神經元死亡，提示其可能用于PD治療[7, 8]；舒尼替尼可對抗東莨菪堿誘導的小鼠認知障礙[10]；靛玉紅-3-肟和7-溴-靛玉紅-3-肟能對抗側腦室注射Aβ誘導的AD小鼠認知能力下降[11]；此外，靛玉紅和SU4312還能降低MPTP誘導的小鼠紋狀體單胺類神經遞質下降[12]，對抗海人藻酸誘導的紋狀體損傷[13]。這些研究均顯示3-取代吲哚酮類化合物具有在體神經保護作用，可能用于治療AD、PD等神經退行性疾病。

2 3-取代吲哚酮類化合物通過多靶點作用產生神經保護

3-取代吲哚酮類化合物產生神經保護作用的靶點是什么？是否與其RTK抑制活性有關？我們發現不具備3-取代吲哚-2酮結構的RTK抑制劑并不能產生類似的神經保護作用，提示3-取代吲哚酮類化合物神經保護作用可能不依賴其RTK抑制活性，而是通過作用其他靶點實現[7]。

c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)通路是神經元凋亡的重要調節通路，與神經元退行性丟失密切相關。活化的JNK蛋白可磷酸化下游轉錄因子c-Jun的Ser63和Ser73位點，激活c-Jun，進而誘導神經元凋亡。撤鉀或雙氧水刺激可通過激活JNK通路、磷酸化c-Jun，誘導小腦顆粒神經元凋亡；MPTP也可通過激活JNK通路誘導中腦多巴胺能神經元死亡。JNK抑制劑可阻止這些刺激誘導的神經元凋亡，顯示抑制JNK通路具有神經保護作用。體外激酶活性實驗顯示舒尼替尼、靛玉紅-3-肟等3-取代吲哚酮類化合物對JNK磷酸化有抑制作用。其中，靛玉紅-3-肟對JNK三個亞型(JNK1、JNK2和JNK3)的半抑制劑量(IC50)分別為0.8、1.4和1.0 μmol·L-1[14]。靛玉紅-3-肟在體外培養的小腦顆粒神經元和皮層神經元可劑量依賴性阻斷撤鉀以及秋水仙堿誘導的JNK通路激活、阻止神經元凋亡[8]。以上結果顯示抑制JNK通路可能是3-取代吲哚酮類化合物實現神經保護的重要方式。

糖原合成酶激酶3β (glycogen synthase kinase-3β，GSK3β)也參與神經元退行性死亡。GSK3β是Aβ、MPTP等神經毒素產生毒性的關鍵激酶。這些神經毒素通過改變GSK3β磷酸化狀態(抑制Ser9位點磷酸化、促進Ser396位點磷酸化)，增加GSK3β活性，誘導神經元凋亡。此外，GSK3β還可抑制神經干細胞增殖。因此，GSK3β抑制劑可通過促進神經元存活和神經干細胞分化聯合產生神經保護。舒尼替尼、GW5074、靛玉紅、靛玉紅-3-肟等3-取代吲哚酮類化合物可直接抑制GSK3β。其中，靛玉紅對GSK3β的抑制有高度選擇性，可有效逆轉GSK3β活性增加誘導的tau蛋白磷酸化和細胞凋亡[15-16]。靛玉紅-3-肟抑制GSK3β的IC50更達22 nmol·L-1[17]。靛玉紅-3-肟通過降低GSK3β活性，阻止MPTP誘導的大鼠中腦多巴胺能神經元死亡，改善動物運動能力[11, 16]。6-溴-靛玉紅-3-肟可通過抑制GSK3β劑量依賴性地降低tau蛋白水平和tau蛋白的磷酸化，其IC50為1.5 μmol·L-1[18]。此外，靛玉紅-3-肟和7-溴-靛玉紅-3-肟可通過抑制GSK3β，降低Aβ誘導的tau蛋白異常磷酸化，阻止高脂飲食誘導的小鼠認知障礙[17, 19-20]。因此，GSK3β也是3-取代吲哚酮類化合物神經保護作用的重要靶標。

細胞周期素依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)是調節細胞周期的關鍵蛋白。其中CDK5在神經退行性疾病中有重要作用。CDK5活性在AD、PD的嚙齒類模型顯著增加，活化的CDK5可通過促進Aβ、tau、α-synuclein等疾病相關蛋白異常聚集，誘導神經毒性，促進神經元死亡。舒尼替尼、靛玉紅、靛玉紅-3-肟等3-取代吲哚酮類化合物均可直接抑制CDK5活性，其中，舒尼替尼抑制CDK5的IC50為4.2 μmol·L-1[21]。舒尼替尼在小鼠海馬神經前體細胞中可抑制HIV外膜糖蛋白gp120引起的CDK5活化，阻止神經元死亡[21]。舒尼替尼在gp120轉基因小鼠還能阻止tau蛋白異常磷酸化，預防神經元退行性死亡，提高動物認知能力[21]。靛玉紅-3-肟不僅是有效的CDK抑制劑，而且毒性低、分子量小、有較好的細胞膜通透性，可以改善AD大鼠的學習記憶功能，減少Aβ誘導的額顳葉皮層和海馬CA1區神經元凋亡[11]。此外，舒尼替尼、靛玉紅-3-肟通過抑制CDK5，可阻止tau和DARPP-32等蛋白異常磷酸化，產生神經保護[11]。由此可見，CDK5也是3-取代吲哚酮類化合物實現神經保護的重要靶點。

肌細胞增強因子2(myocyte enhancer factor-2，MEF2)是促進神經元存活的重要轉錄因子。MEF2轉錄活性的調節機制復雜，在神經元細胞質中，MEF2可被GSK3β、CDK5等激酶修飾。經修飾的MEF2難以入核，無法執行轉錄功能。Aβ、MPTP、6OHDA等神經毒素可通過促進MEF2失活誘導神經元死亡。靛玉紅-3-肟等3-取代吲哚酮類化合物除直接抑制GSK3β、CDK5、JNK等激酶活性外，還能直接增強MEF2轉錄活性，促進SH-SY5Y細胞存活[22]。SU4312可通過直接增強MEF2轉錄活性逆轉MPTP誘導的黑質多巴胺能神經元損傷，抑制氧化反應，維持線粒體功能，阻止多巴胺及其代謝物的消耗，抑制大鼠運動能力下降[13]。

一氧化氮合酶(nitric oxidase synthase，NOS)在神經元退行性死亡中也發揮關鍵作用。神經元性一氧化氮合酶(neuronal NOS，nNOS)過度激活可產生過量NO，進而誘導神經元死亡。Aβ誘導的內源性NO水平升高是AD早期神經元死亡的主要原因。NO還參與了MPP+/MPTP等PD相關神經毒素誘導的神經元損傷。舒尼替尼、SU4312和SU5416在體外可直接抑制nNOS活性，IC50分別為9.6、22.7、19.0 μmol·L-1。分子對接實驗顯示3-取代吲哚酮類化合物可能通過其吲哚-2-酮母核與nNOS的heme基團相互作用，抑制nNOS。這些化合物在小腦顆粒神經元可通過抑制nNOS活性，阻止撤鉀及MMP+等刺激誘導的NO水平上升和神經元死亡[7, 23]。此外，靛玉紅-3-肟還可通過降低NO水平，阻止細菌脂多糖誘導的小膠質細胞損傷[24]。以上結果顯示3-取代吲哚酮類化合物可通過抑制nNOS、降低NO水平產生神經保護。

我們最近研究還發現，3-取代吲哚酮類化合物可通過抑制神經遞質代謝過程中重要蛋白發揮抗神經退行性疾病的作用，如舒尼替尼可競爭性抑制乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)，其IC50低于1 μmol·L-1，可有效阻止腦內乙酰膽堿分解，對抗東莨菪堿誘導的小鼠認知障礙[12]。SU4312能選擇性抑制單胺氧化酶-B(monoamine oxidase-B，MAO-B)，其IC50值為0.2 μmol·L-1[13]。顯示這類化合物還可能通過調節神經遞質系統產生神經保護作用。

3 3-取代吲哚酮類化合物可望發展為新型抗神經退行性疾病藥物

綜上所述，3-取代吲哚酮類化合物可通過JNK、GSK-3β、CDK5、MEF2、nNOS、AChE、MAO-B等多靶點實現神經保護(Fig 2)。由于神經退行性疾病與多因素相關，傳統的單靶點藥物很難阻止神經元死亡，實現對因治療。3-取代吲哚酮類化合物這樣的多靶點神經保護藥物可能是治療神經退行性疾病的重要方向。另一方面臨床藥物安全性確定，且被臨床醫生熟知。因此在“老藥新用”的研發可免除毒理學和藥代動力學評價，較新藥研發大大縮短了成本和時間。3-取代吲哚酮類化合物作為臨床抗腫瘤藥物“老藥新用”開發為治療神經退行性疾病具有極大的優勢，對其神經保護作用及其機制的進一步研究有望獲得一類新型抗神經退行性疾病藥物。

Fig 2 Main anti-neurodegeneration targets of 3-substituted indolones