骨肽原液促UMR106細(xì)胞增殖法的建立及驗(yàn)證

吳彥霖，張 媛，楊澤岸，胡文言，高 華

(1.中國(guó)食品藥品檢定研究院化學(xué)藥品檢定所藥理室, 北京 102629; 2.中國(guó)生化制藥工業(yè)協(xié)會(huì)，北京 100068)

骨肽是從新鮮或冷凍的豬、鹿或胎牛骨提取，加工制成的具有活性的多組分生化藥[1-2]，骨肽類藥物主要成分含有骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMPs)等多種多肽類骨代謝活性因子，以及多種骨修復(fù)所需的無(wú)機(jī)元素、氨基酸及微量元素等[3]。骨肽類藥物臨床上主要用于骨質(zhì)疏松、骨質(zhì)增生、骨折及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病治療，具有刺激成骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)新骨形成，調(diào)節(jié)鈣磷代謝，抗炎鎮(zhèn)痛等藥理作用[4-5]。骨肽原液是骨肽類藥物的原料，具有組分復(fù)雜，活性成分不明確的特點(diǎn)，現(xiàn)行的骨肽類藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)地升部十六冊(cè)，采用理化方法進(jìn)行質(zhì)量控制，不能有效反映其多組分、多靶點(diǎn)的臨床療效[6]，因此建立關(guān)聯(lián)臨床功效的生物活性測(cè)定方法作為其質(zhì)量控制的方法更為合理。

大鼠骨肉瘤細(xì)胞UMR106在形態(tài)和性質(zhì)上保留有成骨細(xì)胞的特征，在研究中被用來(lái)代替成骨細(xì)胞，是一種國(guó)際公認(rèn)的成骨樣細(xì)胞，也是研究骨代謝調(diào)控較好的模式細(xì)胞[7-9]。建立骨肽原液生物活性測(cè)定方法-大鼠骨肉瘤UMR106細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，確定骨肽原液的限值，依據(jù)正交實(shí)驗(yàn)確定方法的影響因素，并參照2015年版《中國(guó)藥典》9101 藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則和9105中藥生物活性測(cè)定指導(dǎo)原則進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證[10]。

基于上述目的，建立骨肽原液生物活性測(cè)定方法研究包括：1)建立UMR106細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)方法；2)正交試驗(yàn)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，確定實(shí)驗(yàn)方案；3)對(duì)建立的骨肽原液促UMR106細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證；4)對(duì)13個(gè)廠家共39批次的骨肽原液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果制定相應(yīng)的限值和判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株大鼠骨肉瘤細(xì)胞株UMR106，購(gòu)于中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心。

1.2 儀器CKX 41倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；1389 A2生物安全柜(美國(guó)Thermo Fisher公司)；3141 CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher公司)；6R離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司)：Z2細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(美國(guó)Beckman Coulter公司)；SYNERGY HT酶標(biāo)儀(美國(guó)Biotek公司)。

1.3 試劑及樣品胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、含谷氨酰胺的DMEM高糖培養(yǎng)基(Glutamine+, Glu+)、不含谷氨酰胺的DMEM高糖培養(yǎng)基(Glutamine-, Glu-)、胰酶均購(gòu)自Gibco公司，批號(hào)分別為1989478、2044404、1998036、2053591；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)購(gòu)自Hyclone公司，批號(hào)AD20616267；CCK-8購(gòu)自東仁化學(xué)科技(上海)有限公司，批號(hào)NN707。 骨肽原液生產(chǎn)廠家及批號(hào)見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 Manufacturer and batch number of bone peptide

1.4 溶液配制生長(zhǎng)培養(yǎng)基：用DMEM高糖培養(yǎng)基(Glu+)配制含10%FBS的溶液；工作培養(yǎng)基：用DMEM高糖培養(yǎng)基(Glu-)分別配制含1%、5%、10%的FBS溶液，上述溶液4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

骨肽的樣品稀釋液：用工作培養(yǎng)基配將骨肽原液稀釋為0.06、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 g·L-1的溶液，臨用現(xiàn)配。

1.5 細(xì)胞傳代取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期UMR106細(xì)胞融合度達(dá)到90%進(jìn)行傳代，吸棄瓶中培養(yǎng)基，取10 mL PBS清洗1遍，加2 mL 0.25% Trypsin置CO2培養(yǎng)箱中消化30 s，加10 mL生長(zhǎng)培養(yǎng)基終止消化，吹落培養(yǎng)瓶上貼壁細(xì)胞，將細(xì)胞懸液移至15 mL離心管中，充分混勻，1 000 r·min-1離心5 min，離心后盡量除去上清液，加入1 mL生長(zhǎng)培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻細(xì)胞沉淀。將細(xì)胞懸液按1 ∶5比例接種至T75培養(yǎng)瓶中，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。

1.6 骨肽原液致UMR106細(xì)胞增殖方法建立將2.2消化后的細(xì)胞用PBS洗2次，每次1 000 r·min-1離心5 min，用工作培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞至所需濃度，每孔100 μL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h。棄去孔內(nèi)完全培養(yǎng)基，每孔加入骨肽的樣品稀釋液，設(shè)不加細(xì)胞的孔為完全空白組，陰性對(duì)照組(等量PBS代替藥物體積)。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后使用CCK-8法進(jìn)行測(cè)定細(xì)胞增殖率，實(shí)驗(yàn)操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

細(xì)胞增殖率/% =(供試品組A值-完全空白組A值)/(陰性對(duì)照組A值-完全空白組A值)×100%

1.6.1線性范圍和最低檢測(cè)限 取2.3細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2 000 個(gè)/孔，用1% FBS工作培養(yǎng)基將廠家B(batch No. 1)和C(batch No. 1)骨肽原液配制為2.1的濃度，每孔分別加入對(duì)應(yīng)的組別藥物100 μL，作用48 h、72 h后計(jì)算細(xì)胞增殖率[7-9]，以細(xì)胞增殖率評(píng)價(jià)骨肽原液促UMR106細(xì)胞增殖活性，確定最低檢測(cè)限。

1.6.2正交實(shí)驗(yàn)確定影響因素 選用廠家B(batch No. 1)的骨肽原液樣品進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，正交設(shè)計(jì)方案：采用L9 (33)正交表，以3因素3水平正交實(shí)驗(yàn)為考察條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，具體見(jiàn)Tab 2和Tab 3。響應(yīng)值為細(xì)胞增殖百分率。 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表如下表所示。

Tab 2 Factors and levels of orthogonal experiment

Tab 3 Arrangement of orthogonal experiment

1.7 方法學(xué)驗(yàn)證[10]

1.7.1重復(fù)性 參考2.3.2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用廠家B(batch No. 1)的骨肽原液樣品進(jìn)行重復(fù)性檢驗(yàn)，按實(shí)驗(yàn)方案：樣品濃度為1.0 g·L-1，培養(yǎng)基血清含量為2.5% FBS，鋪板細(xì)胞數(shù)量為5 000 個(gè)/孔。進(jìn)行3次獨(dú)立試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果并進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.7.2中間精密度 選用廠家B(bath No. 1)的骨肽原液樣品進(jìn)行中間精密度檢驗(yàn)，3名實(shí)驗(yàn)人員按實(shí)驗(yàn)方案：骨肽原液樣品濃度為1.0 g·L-1，培養(yǎng)基血清含量為2.5% FBS，鋪板細(xì)胞數(shù)量為5 000 個(gè)/孔。分別進(jìn)行獨(dú)立試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果并進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.7.3耐用性 選用廠家B(bath No. 1)的骨肽原液樣品進(jìn)行中間精密度耐用性檢驗(yàn)，分別考察實(shí)驗(yàn)中一些測(cè)定條件的微小變化，包括：不同細(xì)胞鋪板密度：4 500、5 000、5 500 個(gè)/孔；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上藥物作用于不同位置；藥物作用時(shí)間：68、72、76 h。測(cè)定結(jié)果不受影響，以確保方法的可靠性。

1.8 限值及判斷標(biāo)準(zhǔn)的制定取2.3細(xì)胞，將13個(gè)生產(chǎn)廠家共39批骨肽原液，每孔加入100 μL含1.0 g·L-1骨肽的樣品稀釋液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后測(cè)定細(xì)胞增殖率。以樣品合格率>60%作為界限，制定骨肽原液的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 建立骨肽原液致UMR106細(xì)胞增殖方法

2.1.1線性及最低檢測(cè)限 骨肽原液藥物濃度在0.06～2.0 g·L-1范圍內(nèi)對(duì)UMR106細(xì)胞的影響見(jiàn)Fig 1。廠家B(batch No. 1)和C(batch No. 1)的骨肽原液對(duì)UMR106細(xì)胞有促進(jìn)增殖作用，在48～72 h、0.06～1.0 g·L-1范圍內(nèi)對(duì)UMR106細(xì)胞增殖作用呈時(shí)間-劑量依賴性，但廠家C的骨肽原液在48 h的2.0 g·L-1濃度劑量增殖呈下降趨勢(shì)，骨肽原液對(duì)UMR106細(xì)胞增殖的最低檢測(cè)限為0.06 g·L-1。

Fig 1 UMR106 cell proliferation of bone peptide solution, manufacturers B and C n=2)

2.1.2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)2.3.2計(jì)算正交試驗(yàn)結(jié)果，在促UMR106細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的3個(gè)因素影響程度是：骨肽原液濃度>培養(yǎng)基血清含量>細(xì)胞數(shù)量。結(jié)合顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)的分析結(jié)果，確定骨肽生物活性測(cè)定方法-UMR106細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)方案為：骨肽原液濃度為1.0 g·L-1，工作培養(yǎng)基血清含量為2.5% FBS，鋪板細(xì)胞數(shù)量為5 000 個(gè)/孔。

2.2 方法驗(yàn)證結(jié)果

2.2.1重復(fù)性結(jié)果 1名檢驗(yàn)人員獨(dú)立對(duì)廠家B(bath No. 1)的骨肽原液樣品進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，UMR106細(xì)胞增殖率均值為247%，RSD=13%，表明此方法的重復(fù)性良好，結(jié)果見(jiàn)Tab 4。

Tab 4 Repeatability for UMR106 cell proliferation experiment (n=4,%)

2.2.2中間精密度結(jié)果 3名實(shí)驗(yàn)人員對(duì)廠家B(batch No. 1)的骨肽原液樣品進(jìn)行1次實(shí)驗(yàn)，按確定方案測(cè)定UMR106細(xì)胞增殖率，增殖率均值為261%，RSD=16%，表明此方法的中間精密度良好，見(jiàn)Tab 5。

Tab 5 Intermediate precision for UMR106 cell proliferation experiment (n=3,%)

2.2.3耐用性結(jié)果 對(duì)廠家B(batch No. 1)的骨肽原液樣品，按確定方案測(cè)定UMR106細(xì)胞增殖率，結(jié)果表明：1)不同細(xì)胞鋪板密度條件下，增殖率均值為224%，RSD=2%；2)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上藥物作用于不同位置條件下，增殖率均值為214%，RSD=5%；3)藥物作用不同時(shí)間條件下，增殖率均值為208%，RSD=8%(Tab 6～8)。

Tab 6 Durability for UMR106 cell proliferation experiment (different cell density) (%)

Tab 7 Durability for UMR106 cell proliferation experiment (cell plates in different positions of 96 well) (%)

Tab 8 Durability for UMR106 cell proliferation experiment (drug treated time)

2.3 限值及判定標(biāo)準(zhǔn)的確定13個(gè)生產(chǎn)廠家39批骨肽原液中，有8個(gè)廠家的骨肽原液促UMR106細(xì)胞增殖率≥150%，5個(gè)廠家的骨肽原液促UMR106細(xì)胞增殖率<150%(Tab 9)。

Tab 9 Proliferation of UMR106 cells by 13 manufacturers (n=6)

3 討論

3.1 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和限值建立骨肽原液致UMR106細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)方法，并參照2015年版《中國(guó)藥典》9101 藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則和9105中藥生物活性測(cè)定指導(dǎo)原則，進(jìn)行重復(fù)性、中間精密度、耐用性等方法學(xué)驗(yàn)證[10]，結(jié)果表明，骨肽原液促UMR106細(xì)胞增殖法重復(fù)性、中間精密度和耐用性良好，實(shí)驗(yàn)中一些測(cè)定條件的微小變化不會(huì)影響細(xì)胞增殖率，此方法可靠。且該方法操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，測(cè)定指標(biāo)與骨肽類制劑藥物的治療作用密切相關(guān)，可作為骨肽原液的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。

結(jié)合3.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出骨肽原液致UMR106細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)論，以1.0 g·L-1骨肽原液藥物濃度作為限值劑量，增殖率≥150%作為符合規(guī)定的判定標(biāo)準(zhǔn)，樣品合格率>60%，限值劑量及判斷標(biāo)準(zhǔn)制定較合理，其中E、F兩個(gè)廠家促UMR106細(xì)胞增殖率接近150%，屬于邊緣產(chǎn)品。13個(gè)生產(chǎn)廠家骨肽原液不同批次間實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，表明實(shí)驗(yàn)方法適用性較好，故可作為骨肽原液生物活性測(cè)定方法，以更好的控制產(chǎn)品質(zhì)量。

3.2 骨形成的階段骨形成的過(guò)程主要涉及四個(gè)階段：骨形成初期成骨細(xì)胞數(shù)量明顯增加，而后進(jìn)入成骨細(xì)胞分化階段，細(xì)胞外基質(zhì)成熟，骨特征性蛋白表達(dá)，促進(jìn)并參與基質(zhì)礦化，最終完成骨形成。 成骨細(xì)胞的數(shù)量決定骨形成的最初速度，大鼠骨肉瘤細(xì)胞UMR106在形態(tài)和性質(zhì)上保留有成骨細(xì)胞的特征，在骨肽類制劑成骨研究中具有代表性[7-9]。骨肽類制劑的臨床藥理作用有刺激成骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)新骨形成，調(diào)節(jié)鈣磷代謝，增加骨鈣沉淀及抗炎、鎮(zhèn)痛等。臨床上主要用于骨質(zhì)疏松癥、骨質(zhì)增生性疾病、骨折及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等治療。成分復(fù)雜、活性成分不明確的骨肽類制劑生物活性評(píng)價(jià)方法的建立應(yīng)以其最主要的臨床治療功效作為靶點(diǎn)，進(jìn)行方法學(xué)研究，因此筆者選擇骨形成中成骨作用進(jìn)行了上述研究。

Glu是細(xì)胞培養(yǎng)基中常用的添加物，但在UMR106 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，Glu的存在對(duì)結(jié)果存在影響。因此在使用該法對(duì)同類多組分藥物進(jìn)行生物活性評(píng)價(jià)研究時(shí)，筆者建議應(yīng)考慮樣品中的Glu含量對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾作用。