黑骨藤提取物中3種活性成分在AA模型大鼠體內的藥代動力學研究

夏 濤，王昌權，李 奎，覃小麗，王愛民，黃 勇，李月婷，鞏仔鵬，鄭 林

(貴州醫科大學 1.貴州省藥物制劑重點實驗室/藥用植物功效與利用國家重點實驗室，2.藥學院，貴州 貴陽 550004; 3.民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550004)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)被認為是一種以關節滑膜炎為主要特征的慢性、全身性自身免疫性疾病，常伴隨著關節破壞，軟骨和骨質損傷，嚴重影響了患者的生活質量和健康[1]。RA的病因復雜，癥狀多樣，研究證實，其發病機制涉及抗原、免疫細胞(CD4+T 細胞)、細胞因子(TNF-α、IL-1β)等多種因素參與的一系列免疫反應[2]。佐劑性關節炎(adjuvant arthritis，AA) 模型臨床表現、免疫學及病理反應等方面類似于人的RA，是研究RA的經典動物模型[3]。因此，選擇AA模型用于實驗研究。

黑骨藤為蘿藦科杠柳屬植物黑龍骨(PeriplocaforrestiiSchltr.)的干燥根或全株，常用于風濕關節痛、跌打損傷等癥的治療，被收載于《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》(2003 年版)中[4]。研究表明，黑骨藤能顯著降低AA模型大鼠的胸腺指數，提高腎臟、肝臟、脾臟指數，能有效降低AA模型大鼠血清、組織液中 IL-1、IL-6和TNF-α含量水平[5]；能顯著減緩AA大鼠關節滑膜、軟骨組織的損傷，修復被破壞的組織，能在一定程度上減緩RA的發展[6]。課題組前期從黑骨藤提取物中分離鑒定了3-O-咖啡?；鼘幩?、4-O-咖啡?；鼘幩?、5-O-咖啡酰基奎寧酸、3，4-O-二咖啡?；鼘幩?、3，5-O-二咖啡?；鼘幩帷?，5-O-二咖啡?；鼘幩?、杠柳毒苷、杠柳苷元等化合物[7]。已有研究報道，黑骨藤提取物中咖啡酰基奎寧酸類單體化合物對人RA成纖維樣滑膜細胞MH7A的增殖速度具有顯著的抑制作用，推測該類化合物可能通過抑制MAPK信號通路的激活，降低NF-κB活性，抑制下游炎癥因子表達而產生抗RA的作用[8-9]。但迄今為止，關于黑骨藤體內過程的研究尚未見報道。且越來越多研究表明，病理狀態會改變中藥藥代動力學特征，對藥物的ADME過程產生一定影響[10]。因此，開展中藥多效應成分在病理狀態下的藥代動力研究學，對于闡明中藥的物質基礎、指導臨床用藥安全、有效等具有重要意義。

鑒于此，在前期的工作基礎上，選擇黑骨藤提取物中3-O-咖啡?；鼘幩帷?-O-咖啡酰基奎寧酸和5-O-咖啡?；鼘幩釣橹笜诵猿煞?，建立血漿中同時測定3種成分的HPLC-MS/MS分析方法，開展黑骨藤提取物在AA模型大鼠體內的藥代動力學研究，探究黑骨藤提取物的藥動學特征，為黑骨藤的藥效物質基礎及體內過程提供參考，為黑骨藤的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑3-O-咖啡?；鼘幩釋φ掌?中國食品藥品檢定研究院，批號：110753-201415，純度≥98%)；4-O-咖啡酰基奎寧酸，5-O-咖啡酰基奎寧酸對照品(四川省維克奇生物科技有限公司，批號分別為：AB7061002，AB7050442，純度均≥98%)；葛根素(江西佰草源生物科技有限公司，批號：BCY-0245，純度≥98%)；黑骨藤提取物(自制，批號：20171113)；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器高效液相色譜儀(日本島津公司)，AB5500質譜(Analyst、MultiQuant工作站，美國AB公司)；Allegra 64R低溫高速離心機(美國Beckman 公司)；AE240 十萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司) ；ZH-2渦旋混合器(天津藥典標準儀器廠)；CQ 250A-TS超聲波清洗機(上海躍進醫用光學器械廠)；MTN-2800D氮吹濃縮裝置(天津奧特塞恩斯儀器有限公司)。

1.3 實驗動物健康Sprague-Dawley大鼠，SPF級，♂，體質量(200±20) g，購自貴州醫科大學實驗動物中心，合格證號SCXK(黔)2018-0001，經貴州醫科大學動物實驗倫理委員會批準(批準號1603125)。

1.4 溶液的配制

1.4.1對照品溶液的配制 精密稱取3種成分對照品適量，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，得3-O-咖啡?；鼘幩?1.114 g·L-1)，5-O-咖啡?；鼘幩?1.024 g·L-1)，4-O-咖啡酰基奎寧酸(1.086 g·L-1)等對照品儲備液。分別精密量取上述3種對照品儲備液100 μL于10 mL容量瓶中定容，用甲醇逐級稀釋得混合系列標準溶液，-20 ℃保存。

1.4.2內標溶液配制 精密稱取葛根素適量于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得葛根素(1.011 g·L-1)儲備液，-20 ℃保存，備用。取內標儲備液用甲醇配制成20.20 μg·L-1的內標溶液。

1.4.3枸櫞酸鈉溶液配制 精密稱取0.32 g枸櫞酸鈉粉末，溶于生理鹽水中，定容至10 mL，得32 g·L-1枸櫞酸鈉溶液，4 ℃保存，備用。

1.4.4黑骨藤提取物制備 黑骨藤藥材30 kg，加8倍量70%乙醇提取2次，提取時間分別為1.5、1.0 h，過濾，合并濾液，減壓濃縮至1 000 g·L-1(以生藥計)，45 ℃真空干燥，即得，提取率7.68%。

1.5LC-MS/MS條件

1.5.1色譜條件 色譜柱：ACEC18-PFP(150 mm×4.6 mm, 3 μm)；流動相：0.1%甲酸乙腈(B)-0.1%甲酸水(A)，梯度洗脫(0～2 min，20%～40% B；2～5 min，40%～50% B；5～5.5 min，50% B；5.5～5.6 min，50%～90% B；5.6～7 min，90% B；7～7.1 min，90%～20% B；7.1～9 min，20% B)；流速：0.6 mL·min-1，柱溫：40 ℃，進樣器的溫度：15 ℃；進樣體積為1 μL。

1.5.2質譜條件 采用電噴霧電離源(ESI-)，毛細管電離電壓：-4.5 kV，離子源溫度：550 ℃；噴霧氣與反吹氣：N2，離子源氣體1 ∶55 psi，離子源氣體2 ∶55 psi，掃描方式為MRM模式檢測，質譜數據采集及處理軟件為Analyst、MultiQuant工作站。3-O-咖啡酰基奎寧酸等3種成分及內標用于定量分析的監測離子，見Tab 1。

Tab 1 Mass spectrometric conditions of three components

1.6 AA模型大鼠的制備取雄鼠8只，測定其足容積及踝關節周長作為基礎值，于每只大鼠右后足足墊皮內注射0.1 mL CFA試劑，7 d后再次免疫，造模21 d。

1.7 血漿樣品的處理取各血漿樣品200 μL，置1.5 mL EP管中，補加甲醇100 μL，依次加入50 μL葛根素內標溶液(20.20 μg·L-1)，10%甲酸水50 μL，渦旋混合(1 min)，加甲醇800 μL，渦旋混合(5 min)，超聲(10 min，100 kHz)，離心(12 000 r·min-1，10 min)，取上清液置離心管中，37 ℃下氮氣吹干。用初始流動相200 μL溶解，渦旋混合(5 min)，超聲(10 min，100 kHz)，離心(13 000 r·min-1，10 min)，取上清液置于進樣瓶中，照“1.5”項下的檢測條件分析。

1.8 動物給藥及血漿樣品采集于造模21 d后，選擇造模成功的SD大鼠8只，口服灌胃黑骨藤提取物87 g·kg-1(以生藥計)，給藥前12 h禁食，自由飲水。于末次給藥后5、15、30、45 min、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h經尾靜脈取約0.3 mL的全血置涂有枸櫞酸鈉的1.5 mL塑料離心管中，6 000 r·min-1離心6 min，上清液用塑料離心管分裝，保存于-20 ℃冰箱中，備用。

2 結果

2.1 專屬性考察取大鼠空白血漿200 μL，除不加葛根素內標外，其余按本部分“1.7”項下操作，獲得空白血漿樣品色譜圖A；將一定濃度標準溶液和內標溶液加入空白血漿，依法操作，獲得相應的標準品色譜圖B；取大鼠給藥后血漿，依法操作得相應的樣品色譜圖C。由Fig 1可以看出，各成分間分離良好，血漿中內源性物質不干擾待測成分的測定。

Fig 1 Typical HPLC-MS/MS chromatogramsA:Blank plasma;B:The rat plasma sample collected after i.g of Periploca forrestii Schltr extract to rats;C:Blank plasma spiked with three components 1.3-O-caffeoyl quinic acid 2.4-O-caffeoyl quinic acid 3.5-O-caffeoyl quinic acid 4. Puerarin(IS)

2.2 標準曲線和線性范圍考察取大鼠空白血漿200 μL，分別加入3個用甲醇按梯度稀釋的混合標準溶液100 μL，配制成相當于大鼠血漿藥物濃度見Tab 2，參照“1.7”項下操作。以待測物的峰面積與內標峰面積之比(A/Ai)為縱坐標Y，各物質濃度(C)為橫坐標X進行直線回歸，權重系數為1/X，求得直線方程，即為標準曲線，結果見Tab 3。定量限(LOQ)定義為S/N≥10，檢測限(LOD)義為S/N≥3[11]。

Tab 2 Concentrations of three standard protocatechuate samples(μg·L-1)

Tab 3 Linar ranges and regression equations of 3-O-caffeoyl quinic acid,4-O-caffeoyl quinic acid,5-O-caffeoyl quinic acid

2.3 準確度和精密度考察按“2.2”項下分別配制3種成分大鼠血漿低、中、高(3-O-咖啡?；鼘幩釣?7.41、139.25、1 114.00 μg·L-1，4-O-咖啡?；鼘幩釣?6.97、135.75、1 086.00 μg·L-1，5-O-咖啡酰基奎寧酸為16、128、1 024 μg·L-1)3個濃度的血漿樣品，按“1.7”項下操作，每個濃度平行5份，日內連續進樣，并與標準曲線同時進行。每個系列濃度做5份，計算日內精密度；3種濃度連續測定3 d，計算日間精密度。結果表明3種成分的日內和日間精密度RSD(%)均小于13%，準確度范圍為85.25%～99.30%，提示該方法準確、可靠、重現性好，符合生物樣品分析方法要求。

2.4 提取回收率和基質效應考察取大鼠空白血漿200 μL，按“2.2”項下分別配制低、中、高3個濃度的血漿樣品(濃度同2.3項下)，每個濃度平行5份，按“1.7”項下方法處理進樣分析，記錄峰面積為A；另取空白血漿200 μL，除不加混合標準溶液外，其余按“1.7”項下方法操作，向上清液中加入相應低、中、高濃度的混合標準溶液和內標，吹干，殘留物以200 μL初始流動相溶解，進樣分析記錄峰面積為B；另取上述低、中、高濃度的混合標準溶液與內標，吹干，殘留物以200 μL初始流動相溶解，進樣分析記錄峰面積為C。計算提取回收率/%=A/B×100%，基質效應/%=B/C×100%。結果表明3-O-咖啡?；鼘幩岬?種成分的提取回收率分別為：84.30%～109.45%、98.52%～111.94%、99.51%～111.55%，基質效應分別為：81.96%～101.35%、84.01%～86.84%、81.19%～87.52%，結果表明提取回收率符合生物樣品分析方法要求。

2.5 樣品穩定性實驗按“2.2”項下分別配制3種成分的血漿低、中、高3個濃度(濃度同3.3項下)QC樣品，考察樣品處理后分別至室溫(約25 ℃)中，4 ℃下冷藏24 h，反復凍融(-20 ℃)3次，并在3種環境下的穩定性，結果見Tab 4。結果表明血漿樣本上述處理條件下均穩定，滿足生物樣品分析方法要求。

Tab 4 Stability(24 h at room temperature, 24 h storedat 4 ℃, Freeze-thaw cycles) of three components in rat

2.6 黑骨藤提取物在AA模型大鼠體內藥動學比較研究AA模型大鼠口服黑骨藤提取物后，應用建立的HPLC-MS/MS分析方法測定大鼠體內3-O-咖啡酰基奎寧酸等3種成分的血藥濃度，平均血藥濃度-時間曲線見Fig 2。采用 WinNonlin 6.4軟件對藥物在大鼠體內的動力學過程進行非房室模型擬合并計算其相關藥動學參數見Tab 5。

Tab 5 Pharmacokinetic parameters of three components after i.g of Periploca forrestii Schltr.

Fig 2 Concentration-time profiles of three components after i.g of Periploca forrestii Schltr.

3 討論

建立HPLC-MS/MS分析方法，采用ESI-1源、多反應監測模式(MRM)，同時測定AA模型大鼠血漿中3-O-咖啡?；鼘幩岬?種成分的濃度，該分析方法具有測定時間較短、專屬性好、內源性干擾小等特點[12]，并將該分析方法成功地應用于黑骨藤提取物的藥代動力學研究。預實驗中考察了生物樣品處理方法，最終確定先用10%的甲酸酸化血漿，再加入甲醇沉淀蛋白進行血漿樣品的處理，該方法得到的峰較尖銳、基線較平穩，且回收率和基質效應滿足生物樣品的分析要求。

非房室模型假設藥物末端以單指數消除，不受房室模型的限制，適用于大多數藥物[13]。因此試驗采用藥動學軟件WinNonlin 6. 4的非房室模型處理數據，用時間-血漿濃度曲線下面積(AUC)、平均滯留時間(MRT)、達峰濃度(Cmax)、達峰時間(Tmax)、半衰期(t1/2)、表觀分布容積(V)、清除率(CL)等參數描述黑骨藤提取物中3-O-咖啡?；鼘幩岬?個指標性成分在AA模型大鼠體內的藥動學過程。Cmax、Tmax是衡量藥物吸收程度和速率的主要參數，研究結果顯示，口服黑骨藤提取物后，3-O-咖啡?；鼘幩?、4-O-咖啡?；鼘幩岷?-O-咖啡?；鼘幩岬腡max均為1 h左右，3-O-咖啡?；鼘幩岬腃max較大；AUC是評價藥物吸收程度的一項重要指標，3-O-咖啡?；鼘幩岬腁UC較大；t1/2和MRT是衡量藥物在體內消除快慢和速率的參數，3-O-咖啡?；鼘幩岬膖1/2為5.99 h，MRT為6.93 h，4-O-咖啡?；鼘幩岬膖1/2為7.35 h，MRT為6.93 h；5-O-咖啡酰基奎寧酸的t1/2為6.83 h，MRT為7.42 h。結果表明黑骨藤提取物在AA模型大鼠體內吸收快，消除迅速，不容易在體內蓄積。

本實驗建立了HPLC-MS/MS法測定黑骨藤提取物中3 個單咖啡?；鼘幩犷惓煞值难帩舛?，并成功應用于其藥動學研究，闡明 3 個單咖啡酰基奎寧酸類成分的藥動特征，為黑骨藤藥材的藥效物質基礎研究及創新藥物研制、臨床合理應用提供了一定理論基礎和參考。