金復康口服液對Lewis肺癌荷瘤小鼠PD-1、PD-L1表達及相關免疫因子的影響*

賈 方，王秋月，崔文靜，張 軼，王菊勇

上海中醫藥大學附屬龍華醫院(上海 200032)

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，2018年全球肺癌新發病例約209萬例，死亡約176萬例，分別占惡性腫瘤新發病例11.6%和死亡病例18.4%，居惡性腫瘤第一位[1]。近年來研究者發現程序性死亡受體-1(Programmed death receptor 1,PD-1)及其配體(Programmed death ligand 1,PD-L1)參與腫瘤細胞的免疫逃逸，PD-1/PD-L1信號通路在肺癌細胞中異常表達，表明其與肺癌發生發展及抗腫瘤負調節免疫反應有密切關系。金復康口服液是上海中醫藥大學附屬龍華醫院、國醫大師劉嘉湘先生的臨床實踐總結并研制而成，在治療肺癌方面具有良好的療效及安全性[2]。本研究將 Lewis 肺癌細胞移植瘤小鼠為動物模型，研究金復康口服液對荷瘤小鼠抑瘤作用，并從調節PD-1、PD-L1表達及免疫相關因子方面對其提高免疫功能抗腫瘤作用進行探討。

材料和方法

1 實驗材料

1.1 實驗動物和細胞株：近交系C57BL/6小鼠，6～8周，無特殊病原體，雄性，體質量(20±2)g,32只；動物級別SPF級，購自上海靈暢生物科技有限公司，實驗動物合格證號為SCXK(滬)2018-0003。飼養于上海中醫藥大學動物房，室溫為25 ℃，濕度為70%，自由攝食和飲水。小鼠Lewis肺癌細胞株由中國科學院細胞庫提供，使用10%胎牛血清(FBS)及1%青霉素/鏈霉素的達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)，于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養。

1.2 主要試劑和儀器：金復康口服液由吉林三九金復康藥液有限公司提供，每毫升含1 g生藥(批號：181001)。注射用順鉑(凍干型)(國藥準字 H20023461)，上海中醫藥大學附屬龍華醫院西藥房提供，用生理鹽水稀釋至0.734 mg/ml。DMEM (Hyclone),PBS(天津灝洋),胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素溶液(Hyclone)，胎牛血清(Gibco),BCA蛋白定量試劑盒(碧云天)，10%凝膠試劑盒(雅酶),ECL 超敏發光試劑盒(碧云天),兔抗小鼠PD-1/PD-L1單克隆抗體(Abcam),HRP標記的二抗(arigo),RNA提取試劑盒(EZBioscience生物)，DNA引物(上海生工生物工程有限公司),TAKARA_RR047A PrimeScript RT reagent Kit，TAKARA_RR420A TB Green Premix Ex Taq，ELISA檢測試劑盒(司鼎生物),電子天平(BSA623S賽多利斯科學儀器有限公司)MCO-18AIC CO2細胞培養箱(SANYO，日本)、MSC-Advantage生物安全柜(Thermo Fisher，美國)，低速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)，DMI3000B倒置顯微鏡購(Leica德國)，組織研磨儀(必橫生物) GelDoc XR凝膠成像系統(Bio-Rad，美國)Mini-PROTEANRTetra蛋白垂直電泳系統(Bio-Rad，美國)，EC3410化學發光成，像系統(UVP，美國)，Nano Drop 2000C超微量分光光度計(Thermo Fisher，美國),Step One Plus熒光定量PCR(ABI，美國),infinite F200多功能酶標檢測儀(TECAN，瑞士)。

2 實驗方法

2.1 造模及分組:采用對數生長期Lewis肺癌細胞，將細胞數調整為1×107個/ml。用 1 ml注射器吸取Lewis細胞懸液0.2 ml(含細胞數2×106個)注射于C57BL/6小鼠右腋部皮下，完成小鼠皮下移植瘤的接種。 造模后隨機將小鼠分為四組且每組8只，分別為模型組和金復康低、中、高劑量組。給藥方式：模型組給予生理鹽水0.2 ml，金復康低劑量組為15 g/kg，金復康中劑量組為30 g/kg，金復康高劑量組為60 g/kg，均為每日灌胃1次,連續14 d。

2.2 小鼠移植瘤質量，計算抑瘤率：第14天小鼠脫頸椎處死并取腫瘤組織，用電子天平稱量瘤體質量，計算抑瘤率。抑瘤率(%)=(模型組平均瘤質量-治療組平均瘤質量)/模型組平均瘤質量×100%。

2.3 熒光定量PCR檢測肺癌小鼠腫瘤組織PD-1/PD-L1 mRNA的含量：隨機取腫瘤組織20 mg，每組4個，使用組織研磨儀研磨，制備細胞懸液。根據組織RNA提取試劑盒提取，然后超微量分光光度儀測各樣本濃度(吸光度值260/280≈1.8)。參照逆轉錄酶說明書進行反轉錄。根據目的基因cDNA序列，用Primer 5.0軟件設計引物,序列見表1。采用熒光定量PCR法，反應體系為20 μl。擴增條件：95 ℃2 min變性后，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，循環40次。PD-1(PD-L1)/GAPDH比值采用 2-△△Ct法計算目的基因相對表達水平。見表1。

2.4 Western blot法檢測肺癌小鼠腫瘤組織PD-1/PD-L1 蛋白表達水平：提取各組小鼠腫瘤組織的蛋白，配膠后經電泳蛋白分離后，將蛋白轉印于PVDF 膜上，5%脫脂奶粉搖床上封閉1 h，加入兔單克隆PD-1抗體、PD-L1 抗體(1∶1000)，4 ℃孵育12 h。TBST洗滌4次，8 min/次，而后加二抗即山羊抗兔IgG(1∶10000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌4次，8 min/次。使用化學發光顯像系統曝光，后用Image J蛋白分析軟件分析，結果取相對平均表達量。

表1 引物序列

2.5 肺組織切片HE染色：石蠟包埋肺組織，每個標本切取三張片子，常規脫蠟至水，蘇木素染1 min自來水沖洗1 min，鹽酸酒精3 s,流水沖洗5 min,伊紅染色10 s，梯度酒精上行脫水，二甲苯透明Ⅰ、Ⅱ各20 min,中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。

2.6 小鼠血清中IFN-γ和 IL-12檢測：從給藥開始第14天，將Lewis肺癌小鼠異氟烷麻醉后摘眼球取血，離心分離血清(7000 rpm×5 min)。按照IFN-γ和 IL-12 試劑盒說明書操作，將酶標儀設置450 nm檢測各孔吸光度并計算IFN-γ和IL-12水平。

結 果

1 金復康口服液對Lewis肺癌小鼠的抑瘤作用見表2。在接種Lewis 肺癌細胞約3 d左右，荷瘤對照組和低劑量組可觸及皮下結節，而后逐漸增大，中藥中、高劑量組約5 d左右觸及皮下結節，其中，金復康中、高劑量組生長較緩慢。各組的抑瘤結果顯示：中藥中、高劑量組抑瘤作用明顯，與模型組相比差異具有統計學意義(P<0.05)。

表2 各組小鼠腫瘤質量及抑瘤率比較

2 金復康口服液對小鼠腫瘤組織中 PD-1及PD-L1 mRNA表達水平的影響 見表3。與模型組相比，低、中、高劑量組進行單因素方差分析，結果顯示金復康口服液中、高劑量組降低PD-L1 mRNA的表達，差異具有統計學意義(P<0.05)；低劑量組能升高PD-1 mRNA的表達，中、高劑量組降低PD-1 mRNA的表達,差異具有統計學意義(P<0.05)。

表3 金復康口服液對腫瘤組織中

3 金復康口服液對小鼠腫瘤組織 PD-1 及PD-L1 蛋白表達水平的影響 見表4。與模型組比較，金復康口服液中、高劑量組對PD-1、PD-L1 的表達均具有統計學意義(P<0.05)；與低劑量組比較，金復康口服液中劑量組對PD-1的表達差異具有統計學意義(P<0.05)，高劑量組對PD-L1的表達差異具有統計學意義(P<0.05)。結果提示，金復康口服液能夠降低腫瘤組織PD-1及PD-L1表達。

表4 金復康口服液對小鼠腫瘤組織中PD-1及PD-L1

4 金復康口服液對小鼠肺組織病理學的影響 模型組和低劑量組可觀察細胞形態大小不一且排列不規則，有明顯癌巢，細胞分化差，核大深染，多見核分裂相，且肺組織形態破壞嚴重；中劑量、高劑量組則肺泡形態較好，肺組織形態完整，未見明顯癌巢，細胞形態均一、分化較好(圖1)。

5 金復康口服液對小鼠血清中相關免疫因子(IFN-γ、IL-12)的作用 見表5。中、高劑量組與模型組比較IFN-γ均上升，且中劑量與低劑量組比較IFN-γ升高差異有統計學意義(P<0.05)；中劑量組與模型組比較IL-12上升差異有統計學意義(P<0.05)，而金復康口服液高劑量組IL-12 與模型組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。表明金復康口服液能夠提高荷瘤宿主血清IFN-γ、IL-12的含量。

圖1 各組小鼠肺組織病理學表現(HE染色，×200)

表5 金復康口服液對小鼠血清中IFN-γ、IL-12的作用

討 論

機體在正常狀況下出現腫瘤細胞時，能夠通過免疫監視產生免疫應答殺死腫瘤細胞。腫瘤細胞通過上調免疫抑制細胞或下調免疫激活細胞抑制免疫應答，促使其發生免疫逃逸。PD-1(CD279)在人類和小鼠活化的T、B細胞、調節性T細胞(Tregs)、樹突狀細胞(Dendritic cells,DC)及單核細胞等免疫細胞中表達[3-4]。配體PD-L1 主要在腫瘤細胞和抗原呈遞細胞(APC)上表達[5-6]。PD-1與PD-L1的相互作用發生在腫瘤微環境中。激活PD-1及PD-L1信號通路可形成免疫抑制性腫瘤微環境[7-8]，故而阻斷該通路則可逆轉腫瘤免疫微環境，增強機體免疫細胞的殺傷能力,從而改善惡性腫瘤患者預后情況[9]。研究顯示在非小細胞肺癌、乳腺癌、胃癌、黑色素瘤等惡性腫瘤中PD-L1表達升高，并與這些腫瘤的不良預后相關[10]。PD-1及PD-L1信號通路已經成為免疫檢查點治療新靶點，是調節非小細胞肺癌T細胞反應的關鍵抑制途徑。故而探索阻斷PD-1及PD-L1信號通路的中藥復方，從而提高免疫功能，改善腫瘤免疫環境。

肺癌屬中醫“肺積”“息賁”“痰飲”等病的范疇。《醫宗必讀》談到“積之成也，正氣不足，而后邪氣踞之。”“正氣”指機體對致病因素的防御和抵抗能力，與西醫學的免疫功能有異曲同工之意。非小細胞肺癌的發生、發展與腫瘤的免疫逃逸機制密切相關。金復康口服液主要由黃芪、北沙參、淫羊藿、絞股藍、石上柏、重樓等十二味中藥組成，以益氣養陰、補腎培本等扶正藥物為主，主要針對非小細胞肺癌氣陰兩虛證，其通過增強人體抗病能力，達到控制或縮小腫瘤的目的。臨床研究表明金復康口服液可提高非小細胞肺癌患者生存率，改善臨床癥狀，抑制腫瘤復制、侵襲及轉移，增加化療療效，減輕毒副作用[11-12]。實驗研究表明金復康口服液能夠提高NK、LAK、IL-2的水平[13]，誘導循環腫瘤細胞衰老[14]，調節肺癌Th1、Th2失衡等[15]。本研究擬從PD-1及PD-L1角度研究金復康口服液提高免疫細胞抗腫瘤的作用。

本研究發現金復康口服液對肺癌移植瘤及肺轉移具有一定的抑制作用。從mRNA和蛋白水平而言，金復康口服液能夠顯著降低腫瘤組織 PD-1及PD-L1 水平，以中、高劑量組效果較好，且升高血清中免疫因子IFN-γ、IL-12的表達含量，提示一定劑量的金復康口服液在荷瘤小鼠體內可能通過抑制腫瘤中PD-1及PD-L1 水平，恢復CTL細胞活性從而增強淋巴細胞對腫瘤殺傷能力，同時增加炎癥細胞因子的分泌，發揮免疫調節抗腫瘤作用。這為我們接下來進一步研究金復康口服液調節免疫微環境抗腫瘤的分子機制奠定了一定的基礎。