大麥青稞小孢子高頻再生體系的建立及其在遺傳育種上的應用研究

牛姣姣

摘 ? 要：小孢子培養技術被廣泛應用于十字花科類的作物育種中，并且已經取得不錯的成果，但是在一些禾本科作物方面的應用并不大。一方面，小孢子培育技術的體系建立與實施難度大，另一方面，應用于研究與實踐的材料基因受限。對大麥青稞小孢子高頻再生體系的建立與體系優化進行了闡述，并通過實際的研究育種及其結果的獲得，表明采用這種培養技術方式能夠形成高效的單倍體株系，并經過研究團隊的鑒定與品種和品類的試驗，篩選出所需要的具有很強抗病、耐病、性狀突出的大麥青稞植株，并且使得小孢子高頻再生技術得到了改良，具有很大的市場應用價值與前景。

關鍵詞：大麥青稞小孢子高頻再生體系;建立;遺傳育種;應用

大麥屬于啤酒業的主要原料之一，也為畜牧養殖業提供了很多高質量的能量飼料，同時大麥本身具有很高的營養價值，是食品加工重要而豐富的原料。大麥對于國家經濟發展和人類的健康生活有著重要的意義。青稞屬于大麥的一種，有著非常高的食用價值，是青藏高原人們生存與繁衍的最重要食物之一，對于邊遠地區的發展也極其重要[1]。因此，大麥有著很高的市場需求，在其選育方面顯得尤為重要。

1 ? 大麥小孢子高頻再生體系的建立

在大麥的新品種選育方面，要想提高選育的效率，只有通過提高育種技術實現。近幾年較流行的小孢子培養技術是一種效率較高的單倍體育種手段，已經被應用到大麥、油菜、煙草等農作物上，只是這種技術手段在推廣方面還是會受到一些限制[2]。為了使大麥青稞育種突破這種受限，本文采用了一種在大麥中創建小孢子高頻再生體系的方式，在選取的優質育種材料中取出小孢子進行再生培養，與各地區的相關育種團隊進行合作，培育優質的大麥與青稞的新品種或品系，甚至研究出大麥的遺傳改良方法。

對于生產方面的大麥主栽品種與創建育種材料的小孢子高頻再生體系，是實踐小孢子技術的基礎和前提[3]。通過對小孢子的離體培養再生，獲得大量的加倍單倍體植株，并且建立更永久、穩定的植株體系才能滿足需要，然后對植株分別采取全方位的處理方式，并對其每個步驟采取優化處理，從而針對我國的大麥品種系列建立特有的小孢子高頻再生體系。

通過建立的這一個高頻再生體系，從不同的大麥育種生態區中選擇具有代表性的品系或者品種，并進行游離的小孢子培養研究。對于北方，本次研究所選擇的是來自于黑龍江的墾啤麥7號和甘肅的甘啤6號;對于黃、淮地區，選擇的是秋播大麥;對于江蘇地區，選擇的是蘇啤3號;對于上海地區，選擇的是花30作為對照。經過研究與試驗后結果呈現出：在選擇的這些品種與品類中，其小孢子再生植株最高頻率是花30，達到1×105個/培養皿，也就是平均每培養皿小孢子為378.7株，其會比栽培其他品種的大麥（栽培品種為253株/1×105個小孢子），即花22小孢子的再生頻率提高了很多;與國外所采用的具有很高花培再生頻率的品種，如Igril類的品種而言也更勝一籌，其所采用的最高花培再生頻率為每100個花藥1 009.8株，其再生綠苗植株數目的比例為87.6%，根據每個花藥達到3 000個獲得的游離小孢子，它的再生頻率為每1×105個小孢子的再生頻率是295株。對于6號甘啤，每1×105個小孢子，其綠苗的再生頻率是216.3株，這種小孢子再生頻率的綠苗比很高。因此，通過數據對比可以發現，選育的4份育種材料小孢子的再生綠苗，單皿都在100株以上。除此之外，還有其他的一些白苗，因此，白苗比例不合理的問題是創建小孢子高頻再生體系過程中所存在的問題之一，有待研究與解決。

針對于青藏地區的青稞作物，其小孢子在培養中存在遲鈍基因型問題，還需要對其高頻再生體系進行進一步的優化[4]。

2 ? 大麥小孢子高頻再生技術在育種中的具體應用

本研究是基于已經創建的小孢子高頻再生技術之上，并且結合目前發展后的小孢子的各種培養和選擇的方法上，例如高鹽、低氮等培養新方法，為我國東北、內蒙古、青海等地區的大麥青稞進行了持續的小孢子培養，到2018年底已經實現600多份育種材料的培養，并且超過了12萬株的再生植株。近5年左右的小孢子再生植株培育，實現了每年上萬份的再生與培育，其育苗的成活率高于90%，植株再生結實率超過90%。參與實踐的各大育種團隊通過培育技術，獲得小孢子的加倍單倍體株系后，立即投入試驗中進行鑒定性試驗與育品試驗，從而獲得了一系列的品種與品系優良的大麥青稞，大大提升了我國大麥青稞的區域育種效率。

基于大麥小孢子的高頻再生技術，近幾年我國還對另外3項的遺傳方法進行了新改良，并且已經在其具體應用上取得一些效果。①獲得專利號（201510890842.3）的不用經過種子進行培育的單株小孢子的培養技術方法。通過小孢子培育花30的高頻再生大麥，一方面實現了高頻再生的單株小孢子，另一方面實現了不用經過種子階段進行培育的高頻再生的植株小孢子，這一培育技術目前已經投入運用于大麥花30及西藏地區野生大麥的F1中進行的小孢子培養，解決了野生培育外源基因的栽種難題。②獲得專利號（201611011357.5）的在小孢子高頻再生體系的培育基礎之上的轉基因方法。通過農桿菌對小孢子進行直接性的侵染與游離培育，能夠將其目標基因進行花30的轉換，其轉換效率達到了17%，比通過使用基因槍的方式對花藥進行轟擊方式的效率更高;通過CRISPR/Cas9基因，即在水平方向上對小孢子的靶向基因（白粉病廣譜抗性基因）進行改編，以便提高大麥花30的基因編輯后的效率。③獲得專利號（201410710796.X）的單倍體的培養方法。通過小孢子培育技術獲得單倍體植株，通過誘導叢生芽的方式培育單倍體再生植株，持續進行培育至第5代以后經過檢測仍保持單倍體的倍性，以此建立了穩定的具有單倍體無性繁殖特性的群體，從而解決了單倍體育種的難題，從當下單倍體植株中獲得植物細胞中葉肉細胞的原生質體，并且對其轉基因與基因進行編輯和研究。

3 ? 結語

大麥青稞小孢子技術的發展與研究，使得單倍體植株具有了再生系統，比傳統的花藥培育方法更加有效。據一些研究報道發現，在大麥中對其小孢子進行培養與再生的綠苗，相比傳統的采取花藥的方式培育得更加高效，其效率提高了9.3倍，說明采用小孢子培育的方法能夠使得培育后的綠苗比采用傳統的花藥培育在高頻再生方面更具有發展的潛力。國內外對于小孢子的培育方面已經有不少培育的方法，但是要想使得小孢子的培養技術能夠達到育種的目的，不僅需要在生產上進行大量的實踐與研究，攻克其植株的基因障礙，還需要通過高頻再生綠苗的方式得到所需要小孢子再生的植株。另外，這種培養技術還要用加倍單倍體的方式進行輔助。本文所研究與闡述的這套小孢子高頻再生技術用在大麥青稞大量進行育種方面具有很好的效果，有利于促進我國大麥小孢子育種的進程，也提高了常規育種的效率，在市場上具有很大的應用價值。

本文對突破大麥小孢子育種方面的技術進行研究，創建了高頻再生體系，經過單個培養皿對小孢子進行培養得到了上百株的再生植株，然后在此之上對單倍體細胞進行多種技術方式的誘變、篩選、基因編輯等，使得植株細胞的原生質體發生融合。通過小孢子培養的方式，在其中放進一些非生物脅迫處理，然后對其進行誘導或雜交，使得單倍體植株的耐鹽、耐氮、抗病性等方面得到加強。

經過試驗表明，采取這樣的雜交、誘變等方式，能夠使得小孢子育種技術具有很廣的市場應用與發展價值。近年來，在小孢子培養方式之上發展出一些不用經過單株小孢子培養的方式，對單倍體群體或其材質進行編輯與轉基因的方式，對植株細胞的原生質體培養等方式取得了很大的發展，并且處在不斷的優化中。通過研究與實踐這些培養方法使得大麥的基因遺傳作用被應用在市場中，也為同類型谷類作物的遺傳與基因改良提供了可參考的價值。

參考文獻：

[ 1 ] 徐齊君，王玉林，原紅軍，等.青稞再生體系的建立及優良受體基因型篩選[J].大麥與谷類科學，2019，36（4）：1-10，38.

[ 2 ] 星曉蓉.油菜小孢子培養技術及其在遺傳育種中的應用研究概況[J].青海農林科技，2011（3）：24-26.

[ 3 ] 危文波.農桿菌介導的青稞遺傳轉化體系構建的研究[D].西寧：青海大學，2015.

[ 4 ] 陳志偉，陸瑞菊，黃劍華.大麥空間誘變與小孢子培養復合育種技術及應用[J].上海農業學報，2012，28（4）：160.