SPE-HPLC法測(cè)定行氣坦尼卡爾膠囊中東莨菪堿與莨菪堿含量

祝 婕 康汶鉉 孟文全 尹 強(qiáng)， 穆丹丹

1.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.新疆維吾爾藥業(yè)有限責(zé)任公司，新疆 烏魯木齊 830000

維吾爾藥行氣坦尼卡爾膠囊收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》維吾爾藥分冊(cè)第一冊(cè)[1]，由蘆薈、胡椒、硼砂、天仙子4味藥材加工而成，具有行氣、通便、止痛的功效，臨床用于食欲減退、腹脹、便秘等癥。天仙子(HyoscyamusnigerL.)為此方中重要組成部分，具有解痙止痛、定喘、安神的功效，主治胃痙攣疼痛、咳喘、癲狂[2]。東莨菪堿和莨菪堿[3-4]為天仙子的有效成分，同時(shí)也是毒性成分，能夠有效阻斷中樞M-膽堿能受體，抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)，發(fā)揮鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛作用，但是過(guò)量服用會(huì)導(dǎo)致口干、吞咽困難、頭痛、心動(dòng)過(guò)速等毒性反應(yīng)[5]，因此需對(duì)行氣坦尼卡爾膠囊中此兩種成分的含量進(jìn)行有效控制。

行氣坦尼卡爾膠囊現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中僅有蘆薈苷和胡椒堿的薄層鑒別項(xiàng)，羅嫄等[6]建立了行氣坦尼卡爾膠囊中藥材的薄層鑒別方法及硼砂的含量滴定法，潘偉岑等[7-8]建立了該膠囊中蘆薈苷、胡椒堿含量測(cè)定方法，但未見(jiàn)報(bào)道過(guò)行氣坦尼卡爾膠囊中東莨菪堿與莨菪堿的含量測(cè)定方法。本文采用固相萃取高效液相色譜法(SPE-HPLC)建立行氣坦尼卡爾膠囊中東莨菪堿與莨菪堿的含量測(cè)定方法，以期為有效控制該制劑的質(zhì)量安全提供可靠依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Thermo Fisher Vanquish高效液相色譜儀(四元泵、在線真空脫氣系統(tǒng)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、紫外檢測(cè)器、Chromelon網(wǎng)絡(luò)版在線工作站)；SK-250HP超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；MS205DU電子分析天平(常熟市佳衡天平儀器有限公司)；AL204電子分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-5205(上海亞榮生化儀器廠)；pH計(jì)PB-10[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]；CNW poly-Sery MCX混合型強(qiáng)陽(yáng)離子交換SPE小柱(150 mg，6 mL)。

A.陰性溶液；B.供試品溶液；C.對(duì)照品溶液 1.氫溴酸東莨菪堿；2.硫酸阿托品

1.2 藥品與試劑 行氣坦尼卡爾膠囊(新疆維吾爾藥業(yè)有限責(zé)任公司，規(guī)格：每粒0.3 g；批號(hào)：220510，220509，220508，9211106，9211202，9210903，9190502，9190503，91904002，91904003)，行氣坦尼卡爾膠囊陰性樣品(新疆維吾爾藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：XQ22022101)。氫溴酸東莨菪堿對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100049-201009，純度91.7%)；硫酸阿托品對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100040-201613，純度96.7%)；甲醇(色譜純，F(xiàn)isher Scientific USA)；乙腈(色譜純，F(xiàn)isher Scientific USA)；四氫呋喃(色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；冰醋酸(色譜純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；結(jié)晶乙酸鈉(分析純，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)有限公司)；石油醚(30～60 ℃)(分析純，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)有限公司)；娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Kromasil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-0.1%乙酸鈉(含0.3%四氫呋喃，冰醋酸調(diào)節(jié)pH為6.40)(20∶40∶460)；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按硫酸阿托品峰計(jì)算應(yīng)不低于4000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取氫溴酸東莨菪堿對(duì)照品11.33 mg，硫酸阿托品對(duì)照品23.37 mg分別置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量于容量瓶中，加甲醇制成每1 mL中含氫溴酸東莨菪堿45.3200 μg、含硫酸阿托品124.9000 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 取行氣坦尼卡爾膠囊，傾取內(nèi)容物，精密稱取5 g置于錐形瓶中。加入0.075 mol/L鹽酸-甲醇100 mL，超聲處理30 min(250 W，50 kHz)，室溫下過(guò)濾，濾液減壓濃縮至干。殘?jiān)尤?.1 mol/L鹽酸20 mL溶解，過(guò)濾，取10 mL濾液加入已活化的固相萃取小柱(6 mL乙腈，6 mL水活化)，依次加入淋洗液10 mL水、10 mL甲醇、10 mL石油醚(30～60 ℃)，棄去淋洗液，依次加入5 mL乙腈∶濃氨(98∶2)，5 mL乙腈∶濃氨(95∶5)洗脫，收集洗脫液減壓濃縮至干，殘?jiān)尤? mL流動(dòng)相溶解，0.45 μm濾膜濾過(guò)，即為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液制備 稱取處方中不含天仙子的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下操作方法制備陰性樣品溶液。

2.3 專屬性考察 分別取陰性溶液、對(duì)照品溶液、供試品溶液注入色譜儀，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果如圖1所示。試驗(yàn)表明陰性樣品無(wú)干擾，專屬性良好。

2.4 線性關(guān)系考察 取1 mL中含有45.3200 μg氫溴酸東莨菪堿和124.9000 μg硫酸阿托品的混合對(duì)照品溶液，分別精密吸取0.8 mL、1.6 mL、3.2 mL、6.4 mL、8 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度線，搖勻。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，依次注入液相色譜儀中，記錄色譜峰面積。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，得氫溴酸東莨菪堿回歸方程為Y=0.1483X-0.0437(r=1.0000)；硫酸阿托品回歸方程為Y=0.1729X-0.3048(r=1.0000)。結(jié)果表明氫溴酸東莨菪堿、硫酸阿托品分別在濃度為3.6256 ～ 45.3200 μg/mL，9.9920～124.9000 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 取質(zhì)量濃度分別為14.5024 μg/mL、39.9680 μg/mL的氫溴酸東莨菪堿及硫酸阿托品混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果氫溴酸東莨菪堿和硫酸阿托品的峰面積RSD分別為1.59%、1.59%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品(批號(hào)：220509)6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果測(cè)得6份樣品中東莨菪堿及莨菪堿的平均含量(注：東莨菪堿含量=氫溴酸東莨菪堿含量×0.7894；莨菪堿含量=硫酸阿托品含量×0.8551)分別為13.5137 μg/g、44.2135 μg/g，RSD分別為1.79%、1.01%，表明此方法重復(fù)性良好。

2.7 中間精密度試驗(yàn) 由同一實(shí)驗(yàn)室A、B兩位檢驗(yàn)人員，在不同日期取同一樣品(批號(hào)：220509)6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果東莨菪堿與莨菪堿含量RSD分別為4.91%、5.77% (n=12)，表明方法中間精密度較好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將制備好的樣品(批號(hào)：220509)溶液于室溫下保存，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h測(cè)定，計(jì)算氫溴酸東莨菪堿和硫酸阿托品峰面積RSD分別為1.49%、1.71%，結(jié)果表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知含量的行氣坦尼卡爾膠囊(批號(hào)220509)6份，每份約2.5 g，精密加入適量氫溴酸東莨菪堿、硫酸阿托品混合對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表1和表2。氫溴酸東莨菪堿和硫酸阿托品加樣回收率均符合相關(guān)要求，表明該方法準(zhǔn)確可靠。

表1 氫溴酸東莨菪堿回收率試驗(yàn)表 (n=6)

表2 硫酸阿托品回收率試驗(yàn)表 (n=6)

2.10 含量測(cè)定 按“2.2.2”項(xiàng)下樣品溶液制備方法對(duì)10批樣品進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

天仙子在行氣坦尼卡爾膠囊處方中占比為7.70%，東莨菪堿與莨菪堿含量之和在處方中占比約為0.00616%，且該處方中的胡椒含有大量生物堿成分[9]，對(duì)目標(biāo)成分的含量測(cè)定產(chǎn)生較大干擾。本文建立的一種SPE-HPLC法，實(shí)現(xiàn)了東莨菪堿與莨菪堿的富集與分離，為行氣坦尼卡爾膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供了參考，對(duì)于該品種的質(zhì)量控制具有重要意義。

目前東莨菪堿與莨菪堿的含量測(cè)定方法多為有機(jī)溶劑提取-氨水堿化-三氯甲烷多次萃取[10-12]，造成嚴(yán)重環(huán)境危害和生理毒性。本研究采用的固相萃取技術(shù)避免使用三氯甲烷，極大降低了含量測(cè)定過(guò)程中的危險(xiǎn)性，與已報(bào)道的方法比較，更加安全、靈敏、便捷。

本實(shí)驗(yàn)中對(duì)于提取溶劑濃度、物料比、超聲提取時(shí)間、淋洗劑和洗脫劑的選擇進(jìn)行了考察，并確定了最佳提取條件。并且考察了DIKMA pro Elut PXC、Truserco SCX、Agela Cleanert Florisil等不同廠家和型號(hào)的固相萃取小柱，其中CNW poly-Sery MCX混合型強(qiáng)陽(yáng)離子交換固相萃取小柱對(duì)目標(biāo)成分的分離效果最好。該固相萃取小柱采用改性的苯乙烯-二乙烯苯共聚物作為基質(zhì)，聚合物表面有親水性和疏水性基團(tuán)，對(duì)生物堿類化合物具有高度選擇性。本方法采用混合型強(qiáng)陽(yáng)離子固相萃取小柱分離了行氣坦尼卡爾膠囊中東莨菪堿和莨菪堿兩種托烷類生物堿，為該類化合物的分離檢驗(yàn)方法提供了新的思路。