淫羊藿苷抑制小鼠腰椎間盤退變機制研究

[摘要]目的：建立腰椎間盤退變小鼠模型，觀察淫羊藿苷對Ⅱ型膠原蛋白和基質金屬蛋白酶表達影響，從而研究能改善腰椎間盤退變的機制。方法：隨機選取60只大鼠，分成對照組、假手術組、淫羊藿苷組、活血止痛組，假手術組僅切開不穿刺，其余三組采用纖維環穿刺法建立椎間盤退變模型。四組分別灌胃生理鹽水、生理鹽水，淫羊藿苷、活血止痛膠囊，劑量均為6g/kg·d。結果：COL-Ⅱa上，假手術組最高，對照組最低，淫羊藿苷組、活血止痛組相近；MMP-13、TIMP-1mRNA上，對照組最高，假手術組最低，淫羊藿苷組、活血止痛組相近，COL-Ⅱa、MMP-13、TIMP-1mRNA三個指標中，假手術組和其他三組比較差異顯著（p<0.05），對照組和淫羊藿苷組、活血止痛組比較差異顯著（p<0.05），淫羊藿苷組和活血止痛組比較差異無統計學意義（p>0.05）。結論：淫羊藿苷能影響MMP-13、TIMP-1mRNA表達，從而改善腰椎間盤退變。

[關鍵詞]淫羊藿苷；小鼠；腰間盤退變

[DOI]10.13939/j.cnki.zgsc.2016.31.297

腰椎間盤疾患是臨床上發病率很高的疾病，臨床表現為腰腿痛、下肢感覺異常等癥狀，嚴重影響人們的生活質量。腰椎間盤由纖維環、髓核等組成，主要是膠原蛋白和水分，其中膠原蛋白有Ⅰ型膠原蛋白（COL-Ⅰa）、Ⅱ型膠原蛋白（COL-Ⅱa），外層主要是COL-Ⅰa，其有較強韌性，能抗張力，椎間盤能抗較強壓力，內層有較好的保水能力，能緩沖椎間盤受到的壓力。而椎間盤病變則是膠原蛋白逐漸下降引起。研究[1]稱，生化機制在椎間盤退變中扮演重要角色，炎癥因子能促進基質金屬蛋白酶-13合成，抑制金屬蛋白酶組織抑制劑-1合成，通過使用有抗炎作用淫羊藿苷處理腰椎間盤退變模型小鼠，觀察其是否能夠影響基質金屬表達，延緩椎間盤退變過程。

1材料與方法

1.1實驗材料

（1）實驗動物：隨機選取60只小鼠，均為雄性，平均體重為（15±20）g。

（2）實驗試劑：淫羊藿苷標準品由成都領航者生物技術有限公司生產，純度>98%；RT-PCR試劑盒購自上海星科生物技術有限公司。

1.2實驗方法

（1）干預分組：將60只小鼠隨機分成4組，每組為15只，均飼養1周后禁食12h以上。

（2）模型建立：參考文獻[2][3]內容建立椎間盤退變模型，先將小鼠用5mL水合氯醛腹腔注射麻醉，后將其仰臥固定在操作臺上，在正中線左側1cm附近中部切1.5cm 左右的刀口，將腹肌分離后剪開腹膜再用紗布將鼠的內臟推向對側，將腰大肌分離后使前縱韌帶暴露，即可找到腰4椎間盤，對假手術組直接進行逐層縫合即可。其余三組則用針刺法進行造模。術后1周對四組喂服淫羊藿水提液、生理鹽水和活血止疼藥，假手術對照組喂服生理鹽水。8周后處死試驗動物，取出模型椎間盤放入4%多聚甲醛切片固定后進行觀察。

（3）模型驗證：參考《實用骨科學》診斷標準，經影像學檢查診斷驗證。

1.3方法

（1）觀察指標。用番紅-固綠染色觀察椎間盤形態學變化情況。取出椎間盤置于液氮中進行保存，用逆轉錄-聚合酶鏈反應法檢測COL-Ⅱa、MMP-13、TIMP-1mRNA表達情況。

（2）統計學處理。應用SPSS15.0統計軟件進行統計學處理。

2結果

2.1四組鏡下染色觀察結果

假手術組髓核組織結構完整，基質成分疏松，髓核細胞較多，膠原纖維走形較為清楚，細胞核結構完整。對照組髓核組織皺縮，基質成分較少，膠原纖維粗大，走形紊亂，髓核細胞明顯減少，細胞核不完整。淫羊藿苷組則髓核組織成分減少，膠原纖維粗大，活血止痛組較淫羊藿苷組膠原纖維略小。

2.2四組相關指標比較

COL-Ⅱa上，假手術組最高，對照組最低，淫羊藿苷組、活血止痛組相近，假手術組和其他三組比較差異顯著（p<0.05），對照組和淫羊藿苷組、活血止痛組比較差異顯著（p<0.05）；MMP-13、TIMP-1mRNA上，對照組最高，假手術組最低，淫羊藿苷組、活血止痛組相近，假手術組和其他三組比較差異顯著（p<0.05），對照組和淫羊藿苷組、活血止痛組比較差異顯著（p<0.05），淫羊藿苷組和活血止痛組在COL-Ⅱa、MMP-13、TIMP-1mRNA上比較差異無統計學意義（p>0.05），見下表。

3討論

研究[4]稱，MMP-13可直接降解纖維環中的膠原蛋白。有學者通過對退變小鼠腰椎間盤分化成脂肪細胞抑制作用觀察到其對MMP-1的激活作用[5]，MMP-1和MMP-13在正常情況下是處于動態平衡的，COL-Ⅱa下降則降低氧化物酶體增生物激活受體mRNA水平，且其存在劑量依賴性。結果顯示，MMP-13水平上以假手術組最低，對照組最高，可見MMP-13是以降低MMP-13活性來達到保護COL-Ⅱa作用的。

研究[6]稱，TIMP-1 mRNA能通過干擾COL-Ⅱa信號通路從而抑制COL-Ⅱa活性和連接蛋白表達，造成椎間盤退變。報道[7]認為，抑制ERK1表達能下調TIMP-1mRNA表達，上調Ⅱ型膠原蛋白聚糖表達，其中炎癥指標能通過活化轉錄因子1復合體上調TIMP-1mRNA。COL-Ⅱa下降后會誘導TIMP-1mRNA表達升高，調節椎間盤重塑和纖維環細胞表型變化，能促使軟骨生長和成熟。通過激活纖維環中細胞經典通路從而造成其肥大和基質礦化，從而升高TIMP-1 mRNA水平。[8][9]

淫羊藿苷是以從淫羊藿屬植物淫羊藿中提取的總黃酮為主要有效成分，其在抗腫瘤、增強機體免疫力，改善心血管功能，調節內分泌等方面具有重要藥理學作用。[10]其對腰椎間盤影響性機制可能是通過刺激MCT-E1細胞中mRNA數量增加，從而促進成骨細胞分泌細胞因子TGF-mRNA表達，抑制TNF-α，調節其增殖和分化，促進基質合成和分泌，促進椎間盤膠原蛋白恢復。[11][12]

結果顯示，采用淫羊藿苷后能提高COL-Ⅱa水平，能降低MMP-13、TIMP-1mRNA，從而對退變的腰椎間盤有改善作用。故可作為臨床上改善退變椎間盤的藥物之一。

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[作者簡介]石依姍（1995—），女，河南洛陽人，本科，四川農業大學農學院。研究方向：中草藥栽培與鑒定。

[BP（]以下是尾注。[BP）]

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[作者簡介]王凱敏，女，漢族，中國地質大學（北京）馬克思主義學院思想政治教育專業碩士研究生；馬海軍，男，漢族，法學博士，中國地質大學（北京）馬克思主義學院副教授。主要從事馬克思主義中國化和黨的建設研究。

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[作者簡介]王樂昌（1990—），男，漢族，山東聊城人，中國地質大學（北京）馬克思主義學院碩士研究生。研究方向：馬克思主義基本原理。