EXAKT 硬組織切磨技術在齲齒切片觀察中的應用

徐倩 李紓( 通訊作者)

（山東大學齊魯醫學院口腔醫學院＜山東省口腔組織再生重點實驗室＞＜山東省口腔生物材料與組織再生工程實驗室＞ 山東 濟南 250012）

齲齒是人類口腔常見疾病，齲病的發生嚴重影響人們的身體健康，尤其是兒童[1-3]，因此全面分析齲病發生的成因并及早預防治療具有非常重要的意義[4]。將齲齒制成石蠟切片進行組織形態學觀察是齲齒研究中一種常用手段，牙齒本身硬度較高，制成石蠟切片過程中需要對其進行脫鈣處理，這一過程往往會浪費數月的時間，以EXAKT 硬組織切磨系統為代表的硬組織切磨技術則解決了這一問題。該技術無需脫鈣，將不能用常規方法制備成組織切片的特有軟硬組織標本制成組織切片，并保持組織本身原有的組織形態[5]。

1.材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗組織 人齲齒

1.1.2 儀器 德國EXAKT 組織切磨系統：組織切片機 組織磨片機 載片真空吸附裝置 光固化包埋機 組織脫水浸潤儀 數顯千分尺等。

1.2 方法

將齲齒清洗干凈后置于多聚甲醛溶液固定48 小時，流水沖洗過夜，經過酒精上行脫水和光固化樹脂浸潤，光聚合法包埋成樹脂包埋塊，利用EXAKT 硬組織切磨系統將包埋塊進行切片并打磨至50μm 的薄片，經過甲苯胺藍染色后自然干燥，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察組織形態[6]。

甲苯胺藍染色：鐵蘇木素AB 液1 ∶1 混合，染色5 min(現用現配)，流水沖洗5min，甲苯胺藍染色50s，流水沖洗至合適的顏色。

2.結果

不同齲壞程度的牙齒硬組織切片甲苯胺藍染色結果

切片經過甲苯胺藍染色后，牙釉質呈淺黃色，牙本質呈藍色。未齲壞的正常牙齒切片后可見完整的牙釉質和牙本質（圖1a），淺齲牙齒可見牙釉質表面發生輕度齲壞（圖1b），中齲牙齒可見齲壞已穿透牙釉質發展至牙本質線層（圖1c），深齲牙齒可見牙釉質已經缺失，齲壞已經發展至牙本質深層（圖1d）。

圖1 不同齲壞階段的齲齒組織切片-甲苯胺藍染色

3.討論

常規組織石蠟切片是組織形態學實驗中應用較為廣泛的一種制片技術，在細胞和軟組織的病理學診斷中具有重要的意義[7]。石蠟切片對組織的硬度有要求，牙齒、骨組織等硬組織需要進行脫鈣處理，以降低組織的硬度。酸類脫鈣劑脫鈣速度快，但是對組織的破壞性較大；螯合類脫鈣劑乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid EDTA）對組織的破壞性較小，是應用較為廣泛的脫鈣劑，但是脫鈣周期較長，一般為數周至數月[8]。硬組織切片技術作為近年來快速發展的新興技術，由于其無需脫鈣，既縮短了制片周期又保護了組織的完整性，因高效快捷而被迅速推廣應用[9-12]。

選取了不同齲壞階段的齲齒作為制片樣本，分別為未發生齲壞的正常牙齒、淺齲牙齒、中齲牙齒和深齲牙齒。利用硬組織切片技術將各個齲齒制作成薄切片，經過甲苯胺藍染色后在光學顯微鏡下觀察可見齲壞在牙釉質和牙本質發展的程度。硬組織切片技術可在包埋塊上連續切片，工藝精準且無需脫鈣節省了大量時間。EXAKT 硬組織切磨系統的切割帶鋸含有金剛石顆粒，磨片用的砂紙含有碳化硅顆粒，可以切割硬度較高及含有植入物的組織塊，比如含有金屬種植釘的骨組織、含有支架的血管肌肉組織等，切片厚度均一，劃痕少穩定性高，組織結構形態保持完好，染色后顏色均勻，在光學顯微鏡下和電鏡下均可觀察，還可用于切割纖維樁等材料。硬組織切片目前開發的染色方法較多，常用的有甲苯胺藍染色、蘇木素-伊紅染色、Van-Gieson 染色、Ladewig 染色、Giemsa 染色等，通過顏色、位置、骨界面定量分析等可以觀察牙結石、齲病的發生、種植體與骨組織的結合、新骨生成、血管炎癥反應等。

硬組織切片技術應用廣泛，但制作含有特殊材料種植體骨組織切片時仍有困難，比如氧化鋯陶瓷種植體。氧化鋯陶瓷硬度極高，如果種植體是結晶顆粒粘合而成，質地比較疏松，配套的砂紙可以將其打磨變薄，但相比其它種植體需打磨更長時間；如果種植體是整塊結晶制成，則需借助特殊研磨料才能將其打磨變薄，耗費大量時間且容易破壞骨結合，影響結果分析。硬組織切片的免疫組化技術是另一個亟待解決的難關。免疫組織化學技術是根據免疫學的基本原理-抗原抗體反應來確定組織細胞內的抗原，對其進行定位、定性、定量的技術。原有的包埋劑7200 將組織塊進行包埋后，組織細胞內的抗原信號因化學反應被破壞，無法進行抗原抗體反應，現在已有升級版的包埋劑9100 可以解決這一問題，包埋劑9100 不會破壞遮蓋抗原信號，為后期的抗原抗體反應提供條件。切片在進行免疫組化反應之前需進行脫塑處理，使抗原抗體充分接觸反應，但是現行的脫塑方法極易導致脫片，脫片后組織皺縮變形，原有的形態結構發生變化，植入物與組織極易分離，無法彌補。為解決這一問題，硬組織切片技術在積極改進脫塑技術以減少脫片概率，或者改良制片方法，使切片不用脫塑直接進行免疫組化反應。如果能克服這一難關，硬組織切片技術必將邁進一大步，在組織工程研究領域作出更大的貢獻。

綜上所述，EXAKT 硬組織切磨技術無需脫鈣，可以將不同齲壞程度的齲齒制成組織薄切片，片子厚度均一，經過拋光工藝劃痕少穩定性高，經過染色后在光學顯微鏡下可以清晰的看到齲壞在牙釉質和牙本質中的發展程度，在齲壞觀察等口腔組織工程研究領域有廣泛的應用前景。