生活飲用水中大腸埃希氏菌實驗室檢測探討

黃英哲

（賓陽縣疾病預防控制中心檢驗科 廣西 南寧 530400）

水樣中的細菌包括很多屬和很多種，我國《生活飲用水衛(wèi)生標準》2006版[1]的衛(wèi)生學評價標準是以菌落總數(shù)、總大腸菌群、耐熱大腸菌群和大腸埃希氏菌4 項作為微生物指標。三種大腸菌群的邏輯關(guān)系如下：總大腸菌群＞糞大腸菌群＞大腸埃希氏菌。大腸埃希氏菌，是總大腸菌群、(耐熱)大腸菌群的主要種類。大腸埃希氏菌被檢出，表示水體受到腸道致病菌污染的可能性更大[2]。

生活飲用水微生物指標除了與外界條件有關(guān)外，實驗室檢測內(nèi)部質(zhì)量控制也至關(guān)重要[3]。只有做好實驗室質(zhì)部質(zhì)量控制，才能保證檢測對象結(jié)果真實可靠。為了檢驗本實驗室大腸埃希氏菌檢測能力，本實驗室按照GB/T5750.12－2006 大腸埃希氏菌多管發(fā)酵法，開展了生活飲用水中大腸埃希氏菌檢測的質(zhì)控活動，質(zhì)控活動達到如下目標：

1）使用工作中發(fā)現(xiàn)的耐熱大腸菌群、標準菌株產(chǎn)氣腸桿菌、標準菌株大腸埃希氏菌三種菌進行試驗，觀察不同大腸菌群在EC-MUG 培養(yǎng)基熒光效果，取得陽性標本熒光視覺效果。

2）對使用的試管酸浸泡、水龍水直接清洗處理兩種清洗方法，尋找影響大腸埃希菌熒光效果因素。

3）使用北京EC-MUG 培養(yǎng)基陸橋試劑及青島海博EC-MUG 培養(yǎng)基試劑進行比較試驗，檢驗實驗室常規(guī)使用的試劑廠家是否優(yōu)良。

1.材料與儀器

1.1 EC-MUG 培養(yǎng)基，北京陸橋（批號171220）、青島海博（批號20190610）。

1.2 伊紅美蘭培養(yǎng)基，購自北京陸橋有限責任公司。

1.3 培養(yǎng)箱，36℃±1℃;44.5±0.5℃;波長366nm 紫外燈。

2.方法與結(jié)果

2.1 方法原理

EC-MUG 培養(yǎng)基檢測大腸埃希氏菌是指:大腸埃希氏菌能特異性產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase)，此酶能分解培養(yǎng)基上的MUG 熒光底物釋放出熒光產(chǎn)物，使培養(yǎng)基在366 nm 紫外光下產(chǎn)生特征性熒光，以此技術(shù)來檢測大腸埃希氏菌。

2.2 實驗設(shè)計

2.2.1 蒸餾水、酸浸泡分別處理試管，蒸餾水清洗試管組分別分裝蒸餾水（空白對照）、產(chǎn)氣腸桿菌（陰性對照）、耐熱大腸菌（干擾對照）、大腸埃希菌（陽性對照）；酸浸泡試管組分別分裝蒸餾水（空白對照）、產(chǎn)氣腸桿菌（陰性對照）、耐熱大腸菌（干擾對照）、大腸埃希菌（陽性對照）。檢查不同清洗條件下影響實驗熒光效果因素。

2.2.2 北京陸橋、青島海博兩種不同品牌的EC-MUG 培養(yǎng)基，在鑒定產(chǎn)氣腸桿菌（陰性對照）、大腸埃希菌（陽性對照）熒光效果，檢驗兩種不同品牌在檢測大腸埃希氏菌的優(yōu)劣。

2.3 操作步驟

在總大腸菌群多管發(fā)酵法初發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣或產(chǎn)氣的管進行大腸埃希氏菌檢測。用無菌金屬環(huán)將前述試管中液體接種到EC－MUG 管中。44.5℃培養(yǎng)24 小時，將培養(yǎng)物在暗處用波長為366nm 功率為6W 的紫外燈照射觀察結(jié)果（以下暗室下觀察結(jié)果均為366nm 功率為6W 的紫外燈照射觀察）。

2.4 結(jié)果

以下結(jié)果均為總大腸菌群多管發(fā)酵法基礎(chǔ)上，用無菌金屬環(huán)將前述試管中液體接種到EC－MUG 管中。44.5℃培養(yǎng)24 小時不同環(huán)境條件下的觀察結(jié)果。

2.4.1 蒸餾水（空白對照）、產(chǎn)氣腸桿菌（陰性對照）、耐熱大腸菌（干擾對照）、大腸埃希菌（陽性對照）各自對應(yīng)的蒸餾水清洗試管、酸浸泡過的試管組成兩兩對照熒光觀察結(jié)果見表1。

表1 不同清洗條件下，暗室下366nm 功率為6W 的紫外燈照射熒光效果觀察結(jié)果

結(jié)果說明：（一）蒸餾水清洗的試管及酸浸泡的試管，在各類對照實驗組，他們?nèi)庋塾^察實驗現(xiàn)象是沒有差別的。正常的清洗不是影響各組實驗結(jié)果的因素。（二）空白組明顯為暗室底色，其他對照組均有明顯的乳白熒光。（三）兩兩熒光效果比較：陽性對照組熒光明亮，陰性組比較暗淡，差別明顯（如圖2）；陰性對照組和干擾組熒光效果無明顯差別（如圖1）。

2.4.2 蒸餾水（空白對照）、產(chǎn)氣腸桿菌（陰性對照）、耐熱大腸菌（干擾對照）、大腸埃希菌（陽性對照）在不同觀察環(huán)境下，熒光觀察結(jié)果見表2。

表2 不同觀察條件下的實驗熒光效果對照表

結(jié)果說明：（一）蒸餾、產(chǎn)氣腸桿菌在44.5℃培養(yǎng)24 小時均為清亮，但沒有混濁，預示沒有細菌繁殖；耐熱大腸菌群、大腸埃希菌液體混濁，44.5℃培養(yǎng)24 小時均有菌生長。（二）產(chǎn)氣腸桿菌與耐熱腸菌桿菌熒光效果一致，大腸埃希菌有區(qū)別于其他組別的熒光或顏色反應(yīng)。（三）、產(chǎn)氣腸桿菌、耐熱大腸菌、均有比較明顯的熒光干擾。應(yīng)設(shè)置空白對照、陽性對照，鑒別陰陽結(jié)果（圖1、圖2）。

2.4.3 蒸餾水（空白對照）、產(chǎn)氣腸桿菌（陰性對照）、耐熱大腸菌（干擾對照）、大腸埃希菌（陽性對照）在北京陸橋、青島海博生產(chǎn)的EC－MUG 管實驗結(jié)果，熒光觀察見表3。

表3 暗室下366nm 功率為6W 的紫外燈照射熒光效果觀察結(jié)果

通過產(chǎn)氣腸桿菌與實驗室耐熱大腸菌群在EC-MUG 高溫培養(yǎng)后的熒光效果比較。產(chǎn)氣腸桿菌在高溫中不能生長，液體清亮，也不能分解熒光底物。

3.討論

3.1 有關(guān)文獻及實驗結(jié)果中[4]，試管本身會產(chǎn)生微量熒光。本次實驗使用的試管分兩部分，一部分是用酸浸泡試管七天以上，然后進行蒸餾水清洗；另一部分是直接用水龍頭水直接清洗，兩類試管均165℃2 小時以上高溫滅菌。同一菌株在不同方法處置的試管，實驗效果無差別，說明一般試管可能產(chǎn)生的熒光對實驗沒有影響。

3.2 EC-MUG 培養(yǎng)基試劑本身經(jīng)培養(yǎng)后會溢出一定的熒光物質(zhì)，如果沒有陽性對照作比較，可能會誤以為是真陽性，造成假陽性結(jié)果。因此，初級實驗者或日常工作中，應(yīng)帶標準菌株同步實驗并觀察實驗結(jié)果。

3.3 兩家試劑廠家生產(chǎn)的EC-MUG 培養(yǎng)基，陽性結(jié)果產(chǎn)生熒光效果均顯著，實際操作中，日常生活飲用水中的大腸埃希氏菌試驗結(jié)果與陰性對照相差無異時，可以按未檢出大腸埃希氏菌結(jié)果進行報告。

3.4 GB/T5750.12－2006 檢測大腸埃希氏菌有多管發(fā)酵法、濾膜法、大腸埃希氏菌酶底法。推薦的第一法為多管發(fā)酵法，采用多管發(fā)酵法和酶底物法對大腸埃希氏菌進行檢測，檢出結(jié)果基本一致[5]。在日常生活飲用水監(jiān)測中，第一法相對第二法過濾法更簡便易行；相對第三法酶底法來講，更經(jīng)濟實惠。因此，第一法多管發(fā)酵法，在常規(guī)檢測工作中仍是值得推廣的方法。

3.5 不同稀釋度的大腸埃希氏菌液在EC-MUG 培養(yǎng)液中，產(chǎn)生熒光效果無顯著區(qū)別。因此，總大腸菌發(fā)酵后，在下步實驗操作中，移液管要一管一用，不同發(fā)酵管不能出現(xiàn)交叉污染，防止陽性值偏高。