常見植物原生質體制備和融合實驗探究

李 真 沈 璟

［對外經濟貿易大學附屬中學（北京市第九十四中學） 北京 100102］

原生質體融合是植物體細胞雜交的第1 步，屬于人教版教材高中生物學選修3《細胞工程》中的重要內容。《普通高中生物學課程標準（2017年版）》［1］在概念4“動物細胞工程”的大概念下，要求學生“概述植物體細胞雜交是將不同植物體細胞在一定條件下融合成雜合細胞”，通過該部分的學習能針對生產或生活的某一需求，在細胞工程中選用恰當的技術和方法提出初步的設想。而教材中未開展這一部分的實驗，造成學生僅掌握基本知識，未形成直觀的認識，為了使學生深入理解教材內容和相關知識點，并對植物原生質體制備和融合的過程有感性認識，筆者在課下帶領興趣小組進行了前期實驗摸索和改進，課上通過改進后的流程，使學生成功觀察到原生質體的融合過程。

1 實驗材料、酶解時間和PEG 濃度的設定

教材中提到番茄和土豆原生質體融合，本實驗希望用生活中常見的蔬菜和開花植物進行探究。在設計前學生通過查閱文獻找到酶解液的配方，選擇PEG 誘導融合，選擇何種實驗材料、該酶解液配方是否適用于所選材料的酶解、酶解時間如何掌握，針對這些問題需進行初步探究，具體實驗設計與方案詳見表1。

表1 設計角度與實驗方案

2 實驗步驟［2］

1）配制酶解液（10 mL）：稱取甘露醇0.72 g，纖維素酶0.1 g，離析酶0.01 g，果膠酶0.01 g，100 mmol／L 2-（N-嗎啡啉）乙磺酸（MES）500 μL，55℃加熱10 min，冷卻至室溫加入牛血清蛋白（BSA）0.015 g，100 mmol／L CaCl2800 μL，加水定容至10 mL。

2)配制0.4 mol／L 甘露醇和0.16 mol／L 的CaCl2溶液（pH＝5.8～6.2）和PEG 溶液［20%～40%（w／v）PEG6000，CaCl20.01 mol／L，KH2PO40.00074 mol／L，山梨醇0.1 mol／L］備用。

3）在玻璃平皿上滴加1 mL 左右0.4 mol／L甘露醇溶液，取洗凈晾干的新鮮材料，用解剖刀切成細絲狀，盡量保證刀口平齊。

4）用尖頭鑷子夾取細絲輕柔緩慢地放入酶解液中，25℃、60 r／min 培養1～6 h。

5）取出酶解后的原生質體，置于6 cm 一次性塑料平皿蓋子上過200 目或100 目篩子。

6）濾液轉移至15 mL 離心管中，500 轉離心1 min，去上清液，加入1 mL 0.16 mol／L CaCl2溶液，重懸浮原生質體。

7）將2 種原生質體等量混合后，靜置10 min。

8）滴入等量的PEG 液，靜置15 min 后，顯微鏡下觀察并拍照記錄。

3 實驗結果與討論

3.1 不同酶解時間的影響 本研究用纖維素酶、果膠酶和離析酶（具有半纖維素酶和果膠酶活性）配制酶解液，以酶解法制備原生質體。由于小白菜的葉片光滑、平直、無毛，且主葉脈明顯，便于操作，所以先嘗試使用小白菜作為實驗材料探究。切取1 g 小白菜細絲放入10 mL 酶解液中，震蕩培養酶解1～6 h 后取出，用5 mL CaCl2溶液重懸原生質體，隨后使用血球計數板統計完整的原生質體數量，3 次生物學重復分別計數后求平均值。結果如圖1所示，原生質體的數量呈現先升高后降低的變化趨勢，酶解1～3 h 后視野下可見的原生質體數量較少，4 h 后視野下可見完整的原生質體數量大幅增加，多達2.2×105個／mL，且大部分原生質體完整性較好呈圓球形，4 h 后隨著酶解時間的延長，視野下可見的完整原生質體數量逐漸減少，6 h 時大部分原生質體已破損，呈圓球狀完整原生質體的數量大幅降低，可能是由于酶解時間過長，對原生質體造成一定程度的破壞。

圖1 不同酶解時間原生質體數量統計

3.2 不同材料的影響 為了獲得更多的原生質體同時便于觀察融合程度，本研究中共選擇具有3種顏色的8 種實驗材料，基于小白菜酶解時間的實驗結果，分別用250 mL 錐形瓶震蕩培養4 h 后顯微鏡下觀察（圖2）。鈣菜、快菜、生菜、小白菜、油菜、油麥菜原生質體完整性都較好；從數量看，400 倍視野下生菜、小白菜的制備效果顯著優于其他材料；從顏色看，小白菜和鈣菜的綠色較其他4 種材料略深，這可能與植物的葉片厚度、葉片的形態、細胞的結構有關。除此之外，視野下可見棣棠花（圖2G）和紫甘藍（圖2H）在酶解4 h 后原生質體均完整性好、數量滿足融合需要。

圖2 不同材料酶解4 h 后的原生質體

3.3 不同PEG 濃度的影響 在原生質體融合時，使用不同濃度的PEG 融合效果和處理時間存在較大差異，本實驗中使用小白菜和紫甘藍酶解4 h 后加入不同濃度PEG 誘導15 min。結果顯示（圖3），20% PEG 誘導15 min，大部分原生質體僅是距離靠近但并未融合，使用30% PEG 誘導開始觀察到原生質體的融合，而40% PEG 造成多個原生質體的多聚融合，不利于結果的觀察。隨著時間的延長，原生質體融合的程度逐漸增加。

圖3 不同PEG 濃度下原生質體的融合情況

4 結論

由以上實驗結果可知，不同酶解時間、不同實驗材料、不同PEG 濃度都會影響原生質體的制備和融合效果。酶解時間4 h 時原生質體數量最多、完整性最好；實驗材料選擇紫甘藍、棣棠和小白菜，前二者具有獨特的顏色便于觀察融合情況，而根據實驗結果制備綠色的原生質體選擇生菜或小白菜效果較好，但是由于生菜獨特的羽狀葉，在切取過程中難度大、耗時長，最終選擇小白菜制備綠色的原生質體；使用濃度為20%和30%的PEG 都可誘導原生質體的融合，但是低濃度需要的誘導時間較長，高濃度能適當縮短誘導時間。為了提供更多的可選材料，讓學生在短時間觀察到多種明顯的實驗結果，同時保證充足的實驗準備時間，最終選用小白菜（綠色）、棣棠花（黃色）、紫甘藍（紫色），酶解4 h 后使用30% PEG 誘導原生質體的融合。

利用顯微鏡進行觀察，學生可直觀地觀察到不同顏色不同材料的原生質體融合過程（圖4），課堂上要求學生用手機拍照并標注使用材料、放大倍數等信息上傳到班級群內（圖5）。

圖4 以紫甘藍和小白菜為例的原生質體融合

圖5 學生拍攝的圖片

5 討論

不同植物酶解時間有較大差異。例如，珠眉海棠根采用兩步法酶解需要25℃、40 min［3］；秀珍菇需要30℃酶解3 h［4］；穆惠敏等［5］在28℃情況下，酶解100 min 制備紫菜的原生質體；杜小云等［6］建立“紅顏”草莓瞬時轉化體系，需要31℃酶解10 h。由于不同植物材料的木質化程度不同，酶解時間從幾十分鐘到十幾小時變化較大。本實驗中用不同時間酶解小白菜葉片，4 h 時完整的可后續使用原生質體數量最多，隨著時間的延長，原生質體數量逐漸降低，4 h 后細胞已充分酶解，而震蕩處理會造成原生質體的損傷，所以酶解時間不宜過長。

珠眉海棠根可采用一步法或兩步法酶解，但是兩步法效果更優［3］；齊耀程［7］在制備三生煙葉片與煙花的原生質體時，葉片最佳制備條件為1%纖維素酶、0.5%的離析酶、酶解4 h，而煙花最佳制備條件為0.8%纖維素酶、0.4%的離析酶、酶解2 h，可見不同的實驗材料影響酶解的條件。在本實驗中選用常見菜的葉片為材料，方便獲得，葉片當中含有較多的薄壁組織，酶解較其他植物器官容易。

一般所用的PEG 相對分子質量為1 000 ～6 000，PEG 分子量大于1 000 時，才能誘導原生質體達到緊密的粘連和較為理想的融合效果［8］。廣藿香原生質體融合時，使用40% PEG6000 化學促融30 min，聚合率可達57.19%［9］；白色金針菇菌株3W4 和白色金針菇菌株FMY1203 為親本，雙親原生質體使用40% PEG 進行融合處理［10］；康林芝等［11］使用25%PEG4000 將金針菇與平菇融合。本實驗中使用的是PEG6000，PEG 的濃度較低或處理時間過短，會導致融合效果不理想；濃度過高或處理時間過長，對原生質體的毒害作用增強，可能造成原生質體的活性喪失或減少異核體的融合率。本實驗中40%的PEG6000 處理很可能是由于濃度過高，造成異核體融合率顯著降低，而同種植物的原生質體融合程度大幅增高。

6 小結

《普通高中生物學課程標準（2017年版）》［1］對教師的教學和學生的能力提出了更高的要求，教師應該為學生的科學探究和科學思維能力的培養提供更多的機會，生物學科是實驗學科，知識的掌握和運用應當從實驗中來，到生活中去，真正將看不見摸不到的知識轉變成看得見摸得著的實驗，讓學生體會到生物學科的應用和魅力。本節課是對選修教材的開發和拓展，通過筆者的引導，學生自主開展實驗設計，深刻體會到思考在前行動在后的重要性，實驗需要想清楚、設計好、再行動；同時在操作過程中學生體會到每一個環節的設計都要嚴謹，實驗結果的獲得需要反復驗證，實驗探究是一個曲折的過程，需要不斷的調整、嘗試、重復。此外本節課也能很好檢驗學生對知識的掌握情況，只有辨別出完整原生質體觀察到融合的情況，才能拍照上傳，完成課上任務。筆者認為這是一節體現生物學學科核心素養、有借鑒價值的實驗課。